产品描述
应用：该试剂盒用于聚糖的全甲基化。全甲基化稳定聚糖唾液酸用于 MALDI 质谱分析的酸，并有助于连锁分析研究。套件可与从糖蛋白释放的聚糖一起使用。
描述：该试剂盒包含用于聚糖全甲基化的试剂。注意：该套件不包括甲基碘/碘甲烷（参见运输部分细节）
样品数量最多可容纳 96 个样品。
样品量最多 1 µg 释放的聚糖。
合适的样品任何未标记的纯化聚糖，由 PNGaseF 从糖蛋白中释放，
PNGase A，β‑消除或肼解。
贮存：储存在 2‑8°C。
船运：产品应在 2‑8°C 之间运输。
注意：由于甲基碘/碘甲烷的运输限制，我们无法将此组件与套件一起提供。因此，我们建议购买碘甲烷纯度 ≥99.0% (GC) 来自您当地的化学品供应商。碘甲烷同义词： 甲基碘 CAS 号：74‑88‑4
安全：仅供研究使用。不用于人类或药物使用。
套件内容
该套件包含以下物品：
| 物品 |
数量 |
| 96 孔全甲基化板 二甲基亚砜 (DMSO) 二 |
1 盘 |
| 氯甲烷 (DCM) 96 孔板盖 |
40 毫升 |
| 二氯甲烷 (DCM) |
60 毫升 |
| 96孔板盖 |
1个盖子/垫子 |
| 96孔平衡板 |
1 盘 |
| 空瓶换美 |
1 瓶 |
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注意：该试剂盒可用于处理 1‑96 个样品。该板可扩展，可用于 1 到 96 之间的任意数量的样品。将未使用的试剂盒试剂和未使用的板孔储存在推荐的储存条件下，以便日后用于进一步的样品制备。请在有效期内使用。
需要额外的试剂和设备
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纯度≥99.0% (GC) 的甲基碘 (MeI)（同义词：碘甲烷）。
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纯水：电阻率高于 18 M ‑cm，无颗粒 (>0.22 µm)，TOC <10 ppb。
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板振动器
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Reaction Eppendorf 小瓶（1.5 或 2.0 ml）用于提取样品的最终转移（小瓶需要耐氯仿或二氯甲烷，否则使用玻璃小瓶）。
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pH 指示条
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离心蒸发器（例如Savant、HETO 或类似的）。
-
70% 甲醇 (MeOH)
-
二氯甲烷 (DCM)（用于添加到平衡板）
程序时间线
手动执行 96 个样品的全甲基化过程大约需要 5 到 6 小时。
步骤 1：样品的全甲基化：
| a.聚糖的制备 |
按要求 |
| b.向板中加入 DMSO 和样品 |
15 分钟 |
| c.孵化 |
15 分钟 |
| d.向全甲基化板添加 MeI |
15 分钟 |
| e.孵化 |
60 分钟 |
|
第 2 步：全甲基化样品的提取和储存
| 样品提取 |
3-4 小时 |
| 干燥全甲基化样品 |
10-30 分钟 |
| 添加 70% 甲醇进行储存 |
10-20 分钟 |
|
方法第 1 部分：聚糖的全甲基化
a) 聚糖的制备
N‑聚糖释放后，我们建议用户在全甲基化之前富集和纯化N‑聚糖，以提高反应效率。为此，我们建议使用 96 板。如果需要，可以从单独购买。充实之后，
聚糖需要先被干燥，然后才能被全甲基化。干燥的聚糖最好放在 1.5 mL Eppendorf 小瓶或类似物中。但是，如果您使用96板进行富集并将样品洗脱到 96 孔收集板中，则可以在收集板中将样品干燥，为下一步做好准备。
b) 将 DMSO 和干燥的聚糖样品添加到全甲基化板上
注意：在开始实验之前，请确保 DMSO 完全解冻。 DMSO是固体在 19°C。
用 300 µL DMSO 溶解每个糖链样品。涡旋和离心这些样品。从全甲基化板上剥下透明的密封并切掉悬垂部分。将 DMSO 中的第一个样品添加到全甲基化板的第一个孔中，并使用相同的移液器尖端扰乱底部的固体的井。对剩余的样品重复此过程并记录样品位置。
c) 孵化
用提供的 96 孔硅胶板盖盖住板，将全甲基化板置于约 100‑150 rpm 的板振荡器上，并在室温下孵育 15 分钟。
注意：切割硅胶 96 孔盖/垫条以覆盖包含样品的孔，确保牢固地盖住样品孔。
孵育 15 分钟后，将样品板短暂离心以确保所有样品都在板孔的底部。
注意：空平衡板作为套件的一部分提供。通过添加水（体积重量相等），确保平衡板适当平衡，与含有 DMSO 的样品板。
d) 向全甲基化板添加 MeI
小心取下硅胶板盖，避免样品交叉污染，加入 55 µL MeI到含有样品的孔中。再次用硅胶板盖盖住孔，使其定位以覆盖与以前相同的样品孔并牢固密封。
e) 孵化
确保硅胶盖紧紧密封，以消除挥发性MeI 的损失。
将全甲基化板牢固地放置在 100‑150 rpm 的板振荡器上，注意观察1.2 mL 全甲基化板上的样品内容物没有溢出或交叉污染。将板在室温下孵育 60 分钟
孵育 60 分钟后，将样品板短暂离心以确保所有样品都在板孔的底部。
注意：空平衡板作为套件的一部分提供。通过添加水（体积重量相等）确保平衡板适当平衡，与含有 DMSO 和 MeI 的样品板。
方法第 2 部分：全甲基化聚糖的提取
a) 全甲基化聚糖的提取
取下硅板盖，向每个样品孔中加入 450 μL DCM，然后加入 ~500 μL 水在全甲基化板中。
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为了便于提取步骤，将每个含有样品的孔中的全部内容物转移（DMSO、DCM 和水）到标记的 1.5/2.0 mL Eppendorf 小瓶或玻璃小瓶中。
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转移样品后，通过涡旋混合有机 DCM 层和水层每个样本。将小瓶放在架子上，让两层分开。
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将上层水层丢弃到氯化废物容器中。
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向每个样品中加入 800 μL 水，再次清洗有机层。涡旋每个样品以确保良好的溶剂混合并让两层分离。
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将上层水层丢弃到氯化废物容器中。
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再用800 µL 水重复水洗步骤，并用pH 试纸测试，直到水层不再呈碱性（如果> 7，重复水洗，直到水层的pH ≤ 7）。
b) 干燥全甲基化聚糖
确保完全去除每个样品瓶中存在的顶部水层并丢弃，放入氯化废物容器中。全甲基化聚糖存在于有机 DCM 层中。在离心蒸发器中干燥含有全甲基化样品的有机溶剂。
注意：如果液‑液萃取是在 96 孔板格式中进行的，请使用为平衡离心蒸发器提供的空平衡板。与在 DCM 中含有全甲基化聚糖的样品板相比，通过添加 DCM 或氯仿（体积重量相等）确保平衡板适当平衡。
注意：一旦将样品板和平衡板放入离心蒸发器中，将板在没有真空的情况下旋转 2 分钟，以使 DCM 沉降。 2 分钟后，可以打开真空泵以干燥全甲基化聚糖。
c) 存储样本
在每个样品瓶中加入10 µL 70% MeOH 和干燥的全甲基化聚糖，并通过涡旋混合。在进行质谱分析之前，样品可以储存在 –20°C 的温度下。
参考文献
1.A. Ki‑Irem; GV Avakumov; IV Sidorova and A. Strel Chyonok (1979) "Methylation Analysis in Glycoprotein Chemistry" Chromatography 180: 69‑82
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3.I. Chucanu; CE Costello (2003) "Elimination of Oxidative Degradation During Carbohydrate Peroxymethylation", J. Am. Chemical. Socialist Party. 125: 16213‑16219
4. I. Chucanu; (2006) "Per-O-methylation of carbohydrates for structural analysis by mass spectrometry", Acta Analytica Chem. 576: 147-155
5.I. Chucanu; R. Caprita (2007) "Peroxymethylation of neutral carbohydrates directly from water samples for gas chromatography and mass spectrometry", Analytica Chimica Acta 585: 81 ‑85
6. Shubhakar, A., Kozak, RP, Reiding, KR, Royle, L., Spencer, DIR, Fernandes, DL, Wuhrer, M.: Automated high-pass for glycosylation analysis of biological products using MALDI‑TOF MS amount of permethylation. analytical chemistry. acs.analchem.6b01639 (2016).