唾液酸分析的重要性
唾液酸是在聚糖的非还原末端发现的带负电的单糖。它们对糖蛋白的稳定性和3D构象很重要，并参与许多生物相互作用。唾液酸通常具有关键的功能影响：例如，IgG上N-聚糖的唾液酸化增加了抗炎活性；O-乙酰化唾液酸可改变配体相互作用并影响降解（在EPO上发现O-乙酰基化唾液酸，包括Neu5,9Ac2）；唾液酸的存在还通过阻止位于肝细胞上的无唾液酸糖蛋白受体的摄取而增加糖蛋白的血清半衰期。
自然界中发现了多种唾液酸，但生物制药中N-聚糖和O-聚糖上发现的两种主要唾液酸是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac，或NANA）和N-甘氨酸（Neu5Gc，或NAGA）。人类无法合成Neu5Gc，其在药物中的存在可能导致免疫反应，如慢性炎症。已在正常人血清中检测到抗Neu5Gc抗体，可中和任何含Neu5Gc的生物药物，从而降低药物的疗效。重要的是要意识到，细胞系的选择可以极大地影响生物制药上存在的唾液酸类型，例如，小鼠IgG上的大部分唾液酸通常是Neu5Gc。
因此，为了药物的安全性和有效性，必须在产品生命周期的所有阶段监测唾液酸的水平和类型，以及QC批次间的一致性。因此，唾液酸分析是ICH Q6B生物制药特征描述指南中规定的监管要求。
使⽤套件和标准可以获得的信息
使⽤试剂盒和标准品进行唾液酸定量分析
唾液酸的释放
唾液酸通过糖蛋白样品的温和酸水解释放； 通常从一式三份 50 µg 开始，尽管对于唾液酸化水平非常低的样品可能需要更大的量，例如 单克隆抗体。 我们建议在整个过程中也采取一些过程控制：样品缓冲液或水作为阴性对照； 胎球蛋白糖蛋白和/或定量糖肽作为阳性对照。 样品和过程控制与 2M 乙酸在 80°C 下孵育 2 小时。
DMB 标签
为了实现灵敏检测，释放的唾液酸随后用 1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯.2HCl (DMB) 进行荧光标记 - 见图 1。当唾液酸环打开时，它会在羧酸旁边暴露一个酮基 ，DMB 结合这两个相邻的酮基产生荧光团（其他单糖没有这些相邻的酮基，因此它们没有荧光标记）。 酸水解样品和过程控制加上 Ludger 唾液酸标准品：Neu5Ac (B491176)、Neu5Gc (B491217)、唾液酸参考组 (S491526) 和 Neu5,9Ac2 (N491192)（如果使用）与 DMB 在 50°C 下孵育 3 小时。
液相色谱分析
稀释 Neu5Ac 和 Neu5Gc 标准品以生成用于定量这两种唾液酸的标准曲线。 唾液酸参考面板 (S491526) 和 Neu5,9Ac2 用于唾液酸鉴定
液相色谱条件
溶剂 A = 乙腈:甲醇:水 9:7:84
溶剂 B = 乙腈
荧光：激发ƛ：373 nm； 发射 ƛ: 448 nm
柱温 = 30°C； 样品温度 = 10°C
结果
将样品中 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的峰面积与标准曲线进行比较，以提供样品和过程控制中唾液酸含量的定量数据。 图 2 显示了从小鼠和人类 IgG 释放的唾液酸数据。 小鼠 IgG 具有高水平的非人唾液酸 Neu5Gc，在这种情况下，人 IgG 的唾液酸是小鼠 IgG 的 4 倍。 图 3 显示了 EPO 中唾液酸的数据。 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的绝对量可以通过与标准曲线比较来确定。 然而，EPO 也含有 O-乙酰化唾液酸 Neu5,9Ac2。 在水性条件下，9 位的乙酸盐可以迁移到 8 位，因此很难对 Neu5,9Ac2 进行完全定量的标准品。 因此，唾液酸通过与标准品的保留时间进行比较来确定，Neu5Ac、Neu5Gc 和 Neu5,9Ac2 的相对比例由它们的峰面积确定。
图 2：小鼠和人类 IgG 中 Neu5Ac 和 Nue5Gc 的鉴定和定量。
图 3：EPO 中唾液酸的鉴定和定量。