SS 琼脂的质量控制及测试技术

2021/4/7 12:19:04  作者:中华试剂网


 

SS琼脂不仅可对接种标本同时分离沙门菌和志贺菌,而且对大肠杆菌及其它非肠道致病菌有较强的抑制作用,因而,仍然是目前应用最广泛的一种选择性肠道菌培养基。但由于配制培养基所用原材料( 蛋白胨、胆盐等)的质量及其标准化问题尚未得到全面解决,如仅按国家标准提供的配方投料生产或配制,培养基的质量往往达不到要求。为此,无论是实验室自制SS琼脂,还是从培养基生产厂家直接购买商品化的干燥培养基,在使用之前都必需作适当的质量鉴定,以确保实验室的工作质量。关于SS琼脂的质量控制项目,因实验室条件及用于常规工作还是实验研究等性质不同而有所选择。现将我们在工作实践中选择应用的质量控制项目及有关测试技术介绍如下: 

 

SS琼脂质量鉴定综合参考指标

SS琼脂的质量综合参考指标为:

①加热溶解后不得有肉眼可见不溶物存在,培养基倾注平皿凝固后应看清五号字体;

②凝固后SS琼脂用接种环划线应不破裂;

pH7.0±0.2

④志贺菌生长率大于 40%,菌落呈无色透明,直径不小于1.5mm

⑤沙门菌生长率大于70%,菌落呈无色透明或带黑心(硫化氢阳性菌株),直径不小于 1.8mm

⑥大肠杆菌菌落呈桃红色(或有红色中心),不透明。对大肠杆菌的抑制率应大于85%;

⑦金黄色葡萄球菌被抑制。

 

2  SS琼脂质量控制指标的测试

2.1  感官指标的测试   按规定比例将称取定量的SS琼脂粉(或自制SS琼脂的各成份, 以下同) 加入 pH 6.47.0之间的蒸馏水搅拌均匀加热溶解后,对光观察透明度及不溶物;将琼脂倾注平皿,凝固后置于五号字体上观察字体笔划是否清晰并对光观察平皿色泽,用接种环在表面划线观察是否破裂。

 

2.2  pH值测定    SS琼脂粉按比例加入 pH 7.0的蒸馏水,在室温下充分搅拌均匀,使除琼脂及柠檬酸铁以外的成份全部溶解,放置10min 取上清液用酸度计测定其pH值。 

2.3 肠道致病菌生长率测定  分别取鼠伤寒沙门菌(50013 )、副伤寒沙门菌(50073 )、宋内氏志贺菌(51334 )、福氏志贺菌(51302 )、大肠杆菌( ATCC25922 )、金黄色葡萄球菌(ATCC25923 )6h肉汤培养物,以生理盐水稀释至相当于0.5号麦氏比浊管浓度,再稀释至含菌量为1000cfu/ml左右。取此菌液0.1 ml,用L棒均匀涂布于待测试SS平皿和对照试验的营养琼脂平皿上(每份5个平皿),置36培养24h,计数菌落数并计算细菌生长率。

 

          

 

细菌生长率=试验平皿内的平均菌落数/对照平皿内的平均菌落数×100  

2.4 抑菌试验

2.4.1  大肠杆菌抑制率试验   除大肠杆菌取代肠道致病菌外,其余操作与2.3相同。

抑菌率=1-(试验平皿内的平均菌落数/对照平皿内的平均菌落数×100

2.4.2金黄色葡萄球菌抑制试验  挑取金黄色葡萄球菌的6h肉汤培养物1环,划线接种于待测SS琼脂置36培养24h,观察有无金黄色葡萄球菌生长。

2.5 菌落色泽观察及直径测定    将试验菌株( 鼠伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、宋内氏志贺菌、福氏志贺菌、大肠杆菌) 划线接种于待测SS琼脂,置3624h培养后,以肉眼对光观察菌落色泽,用测微尺法测量单个菌落区的具有代表性的5个单个菌落直径,取其平均值。

简易的测微尺测量菌落直径的方法为:将装有测微尺的显微镜10×目镜置于解剖镜目镜筒中,以油标卡尺置于解剖镜载物台,调节视野至刻度清晰,使目镜测微尺与卡尺分格相平行重叠记录卡尺lmm相当于测微尺的格数,移去尺,将待测菌落平皿置于视野中,使测微尺通过菌落直径,量取被测菌落直径所占测微尺的格数。

菌落直径( mm ) = 被测菌落直径所占测微尺的格数/卡尺 l mm相当于测微尺的格数

3 讨论

3.1  SS琼脂干粉的保质期通常为2年,由于琼脂粉的保质期也是2年,因此,如果培养基厂家生产SS琼脂培养基所用的是即将到期的琼脂,则该SS琼脂粉的保质期将必然受到影响,尤其是凝胶强度指标。如果SS琼脂粉的水分含量高( >6) 或包装不密闭,其保质期将更加无法得到保证。

3.2  SS琼脂加热溶解后,宜全部倾注平皿,因为反复加热溶解不仅使水份过多挥发,而且会使SS琼脂的质量受到影响,对于当天未用完的SS平皿,可用塑料袋包扎后置于410冰箱内贮存7天以上,不影响对肠道致病菌的分离效果。

 

3.3 制备SS琼脂用水的质量要求,有关文献的记载并不一致,在实际工作中蒸馏水、纯净水均有使用。作者认为,pH6.47.0之间的蒸馏水、纯净水均可使用。pH过高或过低,特别是某些“ 纯净水” pH值可低至5.5以下等均不宜用于制备SS琼脂。 

 

3.4 硫化氢阳性菌株在 SS琼脂上的反应远不及WSHE琼脂等。主要表现在H2S阳性菌株菌落黑色中心出现迟缓及黑色中心区域较小。据报道目前国内市售的商品化SS琼脂在24h内出现H2S阳性者为50%,其余50%需36h后出现。因此,在不影响SS琼脂对肠道致病菌分离效果的前提下,适当调正配方,使H2S阳性菌株在24h内出现阳性,对绝大多数沙门菌的分离具有一定的实用价值。 

3.5 肠道菌的菌落直径已成为考核SS琼脂的公认的质量指标之一。某些培养基生产厂家的SS琼脂上志贺菌菌落直径达5mm以上,大肠杆菌菌落直径达3.2mm以上,对肠道菌几乎没有任何抑制性,这种SS琼指的选择性极差。作者认为,沙门菌、志贺菌的菌落直径能达到1.2mm以上即可,单纯的过于追求菌落直径,并无实际意义,而应当将肠道致病菌的生长率及对大肠杆菌的抑制率作为主要考核指标。

 

3.6大肠杆菌菌落在SS琼脂上的胆汁酸沉淀问题,已引起培养基生产厂家及检验界人士的普遍关注,单个大肠菌菌落出现胆汁酸沉淀,将影响对肠道致病菌的检出效果,可采取提高 SS琼脂中所用原料胆盐的质量或使用混合胆盐来解决这一问题。 

 

3.7 有关文献对 SS琼脂上肠道致病菌的菌落色泽的描述很不统一。具体有:无色透明菌落、 灰白色菌落、无色半透明菌落、透明微黄色菌落等。由于菌落色泽与培养基的成份、培养时间、观察条件等均有一定关系,因此,对有关菌落的色泽及透明度,没有必要过于强调某一具体描述的要求。 

3.8 除采用标准大肠菌外,还可考虑采用多份肛拭子标本混和制成杂菌标本,划线接种于待测SS 琼脂,观察其对混合菌的抑菌率,这可能对SS 琼脂的抑菌效果评价更具有实际意义。

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