|
抗生素类别
|
试验菌
|
培养基
|
灭菌缓冲液
PH值
|
抗生素浓度范围
单位/ml
|
培养条件
|
|
编号
|
PH值
|
温度/℃
|
时间/小时
|
|
链霉素
|
枯草芽孢杆菌[CMCCB（B）63 501或CVCC717]
|
Ⅰ
|
7.8～8.0
|
7.8
|
0.6～1.6
|
35～37
|
14～16
|
|
卡那霉素
|
枯草芽孢杆菌[CMCCB（B）63 501或CVCC717]
|
Ⅰ
|
7.8～8.0
|
7.8
|
0.9～4.5
|
35～37
|
14～16
|
|
吉他霉素
|
枯草芽孢杆菌[CMCCB（B）63 501或CVCC717]
|
Ⅱ①
|
8.0～8.2
|
7.8
|
20.0～40.0
|
35～37
|
16～18
|
|
安普霉素
|
枯草芽孢杆菌[CMCCB（B）63 501或CVCC717]
|
Ⅰ
|
7.8～8.0
|
7.8
|
5.0～20.0
|
35～37
|
16～18
|
|
盐霉素
|
短小芽孢杆菌[CMCC（B）63 202或CVCC709]
|
Ⅳ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
10.0～40.0
|
35～37
|
14～16
|
|
庆大霉素
|
短小芽孢杆菌[CMCC（B）63 202或CVCC709]
|
Ⅰ
|
7.8～8.0
|
7.8
|
2.0～12.0
|
35～37
|
14～16
|
|
红霉素
|
短小芽孢杆菌[CMCC（B）63 202或CVCC709]
|
Ⅰ
|
7.8～8.0
|
7.8
|
5.0～20.0
|
35～37
|
14～16
|
|
新霉素
|
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003或CVCC1882]
|
Ⅱ
|
7.8～8.0
|
7.8②
|
4.0～25.0
|
35～37
|
14～16
|
|
青霉素③
|
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003或CVCC1882]
|
Ⅱ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
0.5～2.0
|
35～37
|
14～16
|
|
四环素
|
藤黄微球菌[CMCC（B）28 001或CVCC1600]
|
Ⅱ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
10.0～40.0
|
35～37
|
16～18
|
|
土霉素
|
藤黄微球菌[CMCC（B）28 001或CVCC1600]
|
Ⅱ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
10.0～40.0
|
35～37
|
16～18
|
|
金霉素
|
藤黄微球菌[CMCC（B）28 001或CVCC1600]
|
Ⅱ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
4.0～25.0
|
35～37
|
16～18
|
|
多西环素
|
藤黄微球菌[CMCC（B）28 001或CVCC1600]
|
Ⅱ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
4.0～25.0
|
35～37
|
16～18
|
|
杆菌肽
|
藤黄微球菌[CMCC（B）28 001或CVCC1600]
|
Ⅱ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
0.5～12.0
|
35～37
|
16～18
|
|
林可霉素
|
藤黄微球菌[CMCC（B）28 001或CVCC1600]
|
Ⅱ
|
7.8～8.0
|
7.8
|
2.0～12.0
|
35～37
|
16～18
|
|
泰乐菌素
|
藤黄微球菌[CMCC（B）28 001或CVCC1600]
|
Ⅱ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
2.5～10.0
|
35～37
|
16～18
|
|
大观菌素
|
大肠杆菌[CMCC（B）44 103或CVCC2801]
|
Ⅴ
|
7.8～8.0
|
7.0
|
50.0～300.0
|
35～37
|
16～18
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
① 加0.3%葡萄糖。
② 此缓冲液含3%氯化钠。
③ 系指普鲁卡因青霉素注射液。
补充：抗生素微生物检定试验设计表
|
抗生素类别
|
试验菌
|
培养基
|
灭菌缓冲液
PH值
|
抗生素浓度范围
单位/ml
|
培养条件
|
|
编号
|
PH值
|
温度/℃
|
时间/小时
|
|
丁胺卡那霉素
|
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]
|
Ⅰ
|
7.8～8.0
|
7.8
|
0.9～4.5
|
35～37
|
14～16
|
|
巴龙霉素
|
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]
|
Ⅰ
|
7.8～8.0
|
7.8
|
0.9～4.5
|
35～37
|
14～16
|
|
卷曲霉素
|
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]
|
Ⅰ
|
7.8～8.0
|
7.8
|
10.0～40.0
|
35～37
|
14～16
|
|
碘苄青霉素
|
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]
|
Ⅰ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
5.0～10.0
|
35～37
|
14～16
|
|
去甲万古霉素
|
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]
|
Ⅷ
|
6.0
|
6.0
|
9.0～43.7
|
35～37
|
14～16
|
|
头孢噻肟钠
|
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]63
|
Ⅶ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
0.5～2.2
|
35～37
|
14～16
|
|
头孢羟氨苄
|
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]
|
Ⅱ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
5.0～20.0
|
35～37
|
14～16
|
|
脱氧土霉素
|
藤黄八叠球菌[CMCC（B）28 001]
|
Ⅱ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
4.0～25.0
|
35～37
|
16～18
|
|
氯霉素
|
藤黄八叠球菌[CMCC（B）28 001]
|
Ⅱ
|
6.5～6.6
|
6.0
|
30.0～80.0
|
35～37
|
16～18
|
|
克林霉素
|
藤黄八叠球菌[CMCC（B）28 001]
|
Ⅱ
|
7.8～8.0
|
7.8
|
0.6～1.6
|
35～37
|
16～18
|
|
粘霉素
|
大肠杆菌[CMCC（B）44 103]
|
Ⅵ
|
7.2～7.4
|
6.0
|
614～2344
|
35～37
|
|
[附注]
抑菌圈大小预测试验方法：取双碟6个，分为3组，每组2个，分别加入已融化的琼脂培养基20ml，用陶瓦圆盖覆盖，待凝固后，作为底层培养基置37℃培养箱中保温。另取已融化的琼脂培养基分装于3支大试管中，每支分装20ml。将大试管置恒温水浴中放冷至表1中规定各试验菌的控制温度，分别加入不同量的菌液，制成3种不同浓度的菌层培养基，摇匀，分别吸取3种浓度的菌层培养基各5ml，均匀地摊布在3组底层培养基上，每组双碟用一种浓度的菌层培养基。然后按一剂量法、二剂量法或三剂量法用所欲测定抗生素的标准品溶液测定。测量各组双碟抑菌圈的直径，选择抑菌圈直径合适（一剂量法标准品溶液的中心浓度所产生的抑菌圈直径应为15～18mm；二剂量法标准品溶液的高剂量所产生的抑菌圈直径应为18～24mm；三剂量法标准品溶液的中剂量所产生的抑菌圈直径应为15～18mm）的菌层浓度进行效价测定。
表1 菌 层 培 养 基 的控 制 温 度
|
试验用菌种
|
菌层培养基温度℃
|
|
芽孢悬液
|
60
|
|
大肠杆菌菌液
|
48
|
|
金黄色葡萄球菌菌液
|
48～50
|
|
藤黄八叠球菌菌液
|
48～50
|
|
啤酒酵母菌悬液
|
48
|
（2） 影响效价测定的因素
1.试验菌种：当试验菌种中含有对抗生素敏感度不同的两种或两种以上的菌株时，由于各菌株的最低抑菌浓度不同，在形成抑菌圈时可能出现双圈及边缘模糊不清，影响测量抑菌圈的准确度。因此，应定期将试验菌种进行平板分离，经涂片镜检后，挑选典型的单个菌落作为工作用菌种。陈旧的试验菌培养物也会使抑菌圈边缘模糊，故试验时应用新鲜制备的试验菌液。
2.培养基：培养基的质量对抑菌圈的大小和清晰度都有影响，故对配制培养基用的几种主要原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及琼脂等都应通过预试验选择适宜的品种使用。琼脂的使用量须随季节不同加以调整，使培养基的硬度合适，太软小钢管容易下陷，太硬容易造成抗生素溶液从小钢管底部漏出，可使抑菌圈破裂。
3.双碟的制备：铺双碟底层培养基时，培养基的温度不宜过高，一般将融化后的培养基在室温冷至约70℃时加入双碟中为宜，否则加双碟盖后，底层培养基上会出现冷凝水。当铺菌层培养基时，由于冷凝水的局部冷却和稀释作用，可使菌层培养基凝固后表面不平。菌层培养基一定要铺均匀，这是决定抗生素效价测定的关键。故要求铺菌层时一定要与铺底层时双碟的位置、方向相一致。制备菌层时，培养基的温度不要过高，受热时间也不宜过长，特别是一些对热敏感的试验菌更要注意。否则，可使试验菌部分或全部被杀死，导致抑菌圈破裂或甚至无抑菌圈形成。因此，一定要按规定控制菌层培养基的温度。
在双碟培养基上放置小钢管的距离要合适。当距离太小而抑菌圈又太大时，则相邻两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中抗生素的浓度增大，形成互相影响的卵圆形或椭圆形抑菌圈。在滴加抗生素溶液至小钢管时，若毛细滴管口不圆整或有小缺口，或管内有气泡，均可使抗生素溶液从管口溅出；若加液太满，溶液会从小钢管口溢出；小钢管底部不平，溶液会从底部漏出。以上原因均会造成抑菌圈不圆整或破裂成桃形。防止的办法是滴管口要圆整，管口不能太细，管内不能有气泡，加液时滴管口离校钢管的距离不能太高，小钢管两端面要平。
4.双碟的培养温度和时间：培养箱的温度要均匀，每组双碟要放在同一层盘内，在培养过程中，不要开启培养箱，以免影响培养箱内的温度。双碟的培养时间也与抑菌圈的清晰度有关，如用藤黄八叠球菌作试验菌种测定土霉素、四环素等效价时，在37℃培养16小时后，又是抑菌圈边缘不清晰，可继续培养一段时间，抑菌圈边缘的菌群继续生长并产生色素，则可使抑菌圈逐渐变清晰。
5.抗生素污染：无抑菌圈形成的原因，大多由于抗生素污染所致。因此，在进行抗生素效价测定时，要严防抗生素污染。防止的办法是将配置和稀释抗生素溶液所用的容器与制备培养基所用的容器严格分开，切不可将抗生素溶液撒于地面，以免抗生素附着在微小尘埃上随风飘落在双碟琼脂培养基上，而造成抑菌圈破裂或无抑菌圈形成。
6.标准品：抗生素微生物检定发的实验设计师采用标准品与供试品对比试验的平行线原理。因此，要求标准品与供试品必须是同质的抗生素。如标准品与供试品所含的活性物质不同，则标准品和供试品德两条剂量反应线不成平行直线关系，就不能按平行线原理供试计算效价。各种抗生素都有它同质的标准品，决不能用这一型抗生素组分制备的标准品，去测定另一型抗生素的供试品