匿名
2021/4/15 10:11:55
实验方法
Hoechst-PI染色法检测细胞凋亡
亚“G1 ”峰方法简便，但只是代表G0 /G1 期发生凋亡的细胞，S期和G2 期细胞凋亡发生于G1 峰后，无法观察。此外，由于全部细胞均经固定，因此不能区别死细胞和活细胞。Hoechst-PI染色则可弥补上述不足。Hoechst 33258 可被活细胞摄取，与DNA结合在紫外光下呈蓝色荧光。继而PI使死细胞着染产生红色荧光。因此在细胞二维直方图上根据红蓝两种荧光可分辨三种细胞：正常活细胞对染料有拒染性，蓝色和红色荧光均较少；凋亡细胞有膜通透性改变，主要摄取Hoechst染料，表现为强蓝色荧光，弱红色荧光；坏死细胞由于有很强的PI嗜染性并可覆盖Hoechest染色，故呈弱蓝色强红色荧光。
【材料及试剂】
（1）碘化丙啶（PI）贮存液：100mg/ml，4℃避光保存。
（2）Hoechst 33258贮存液：100mg/ml，4℃避光保存。
（3）0.01mol/L PBS pH 7.0~7.2
【操作步骤】
（1）常规制备单细胞悬液；
（2）加入Hoechst 33258 溶液，使其终浓度为1mg/ml，37 ℃水溶，7分钟；
（3）冰上冷却， 离心弃染液， PBS重悬；
（4）加入PI染液，使其终浓度为5mg/ml，冰浴；
（5）离心弃染液，PBS洗一次，进行流式细胞仪进行分析，、直外激光检测记录400~500nm处蓝色荧光和大于630nm处红色荧光；
【结果判断】
正常对照细胞呈弱蓝色及弱红色荧光；凋亡细胞呈蓝色及弱红色荧光，坏死细胞呈强红色及弱蓝色。