产品描述

应用：用于用 2‑氨基苯甲酰胺酸 (2‑AB) 标记游离聚糖。

描述：该试剂盒包含用于将染料与聚糖的游离还原端偶联的试剂，通过还原胺化反应。

染料特性：质量 = 136.15

                    荧光， ex = 320 nm， em = 420 nm。

样品数量通常，每组标记试剂最多 15 个单独的分析样品。

每个样品的样品量从 25 pmol 到 25 nmol 聚糖。

合适的样品可以标记任何带有游离还原末端的纯化聚糖。

结构完整性唾液酸、岩藻糖、硫酸盐或磷酸盐没有可检测到（< 2 摩尔%）的损失。

标记效率通常 > 85 %（取决于样品）。标记选择性本质上是化学计量标记。

贮存：在室温下避光保存。远离热源、光源和水分。所提供的试剂至少可稳定保存两年。

船运：该产品可以在环境温度下运输。

处理：确保使用的任何玻璃、塑料制品或溶剂不含糖苷酶和环境碳水化合物。使用无粉手套进行所有样品处理  程序并避免污染环境碳水化合物。所有涉及标记试剂的步骤都必须在干燥的环境中进行玻璃器皿和塑料器皿。一旦打开单个试剂瓶，其内容物应⽴即使用，过量后根据当地安全规定丢弃。

安全：仅供研究使用。不用于人类或药物使用

套件内容

每个标记反应组由以下各一个小瓶组成：

需要额外的试剂和设备

• 加热块、烤箱或类似的干式加热器（不能使用水浴）设置为 65°C

• 0离心蒸发器（例如 Savant、Heto 或类似产品）

• 反应瓶（例如聚丙烯微量离心瓶）

• 注意：如果进行可选的标记后样品净化，则需要更多试剂

标签的时间线

标记程序（包括可选的标记后样品清理）通常需要 4 ‑ 5小时：

还原胺化反应

1. 席夫碱基阵型

这需要具有自由还原末端的聚糖，该末端在闭环（环状）之间保持平衡和开环（无环）形式。染料的伯氨基对染料进行亲核攻击无环还原末端残基的羰基碳形成部分稳定的席夫碱。

2. 减少席夫碱。

席夫碱基亚胺基团被化学还原以产生稳定的标记聚糖。

通过还原胺化用 2‑氨基苯甲酰胺酸 (2‑AB) 标记聚糖

标签协议大纲

聚糖标记试剂盒设计用于聚糖的荧光团或发色团标记 自由还原末端。标记的聚糖之后可以进行高灵敏度荧光检测或在各种色谱和结构序列分析过程中监测紫外吸光度。这些包括HPLC 柱色谱和使用外切糖苷酶测序

标记程序的概要如下：

1准备聚糖：通过去除可能干扰的污染物（例如盐和去污剂）来制备聚糖样品  与标签程序。

2干燥聚糖：将样品放入反应瓶中并晾干。

3准备标记试剂：通过混合试剂盒中的试剂制备新鲜的染料标记溶液。

4向聚糖添加标记试剂：在每个样品中加入少量的标记溶液。

5孵化：孵育样品以使标记反应进行。

6贴标后清理：孵育后，如果需要（取决于后续分析程序），去除多余的使用简单的清理程序标记试剂。

7存储或分析标记的聚糖：标记的聚糖现在可以进行分析了。

样品制备

待标记的聚糖样品，无论是纯化的聚糖还是聚糖混合物，都必须含有游离的还原性末端，无颗粒和无盐，并存在于挥发性溶剂系统（最好是纯水）中。

以下物质可能会干扰标记反应，必须先从聚糖样品中去除

• 非挥发性溶剂

• 非挥发性盐，特别是过渡金属离子

• 洗涤剂

• 染料和染色剂，例如考马斯蓝

标准样品制备方案如下：

1纯化聚糖：如有必要，使用其中一种策略从样品中去除非碳水化合物污染物中概述。

2将样品转移到反应瓶中：对于从典型糖蛋白中获得的聚糖池，样品量应在 100 钠摩尔 ‑ 50 纳摩尔之间。使用单个纯聚糖可以标记和检测低至 5钠摩尔，在随后的 HPLC 分析中。合适的反应瓶包括小型聚丙烯微量离心管和用于 PCR 工作的试管。

3干燥样品：理想情况下，样品应使用离心蒸发器进行干燥。如果无法做到这一点，则可以谨慎使用冷冻干燥（冻干）（特别是确保样品干燥至小而紧凑的小瓶底部的质量）。请勿将样品置于高温 (> 28°C) 或极端 pH 条件下，因为这些条件会导致酸催化的唾液酸损失（高温、低 pH）或聚糖的差向异构化还原终点（在高 pH 值下）。

4准备 DMSO‑乙酸混合物：将 150 μL 冰醋酸添加到DMSO 小瓶中，并通过移液器动作混合。小心轻敲或轻弹安瓿瓶上半部分的内容物，然后打开安瓿瓶，然后小心地打开安瓿。如果 DMSO 被冷冻，则在烤箱或加热块中将小瓶（打开前）轻轻加热至 30oC 至 65oC 之间。

5加入染料：将 100 µL DMSO‑乙酸混合物加入一瓶2‑AB（2‑氨基苯甲酰胺酸）中染色并混合直到染料溶解。

6添加还原剂：将溶解的染料加入到氰基硼氢化钠（还原剂）小瓶中，然后混合吸管动作直到还原剂完全溶解，制成最终的标记试剂。如果还原剂难以溶解，则将小瓶在 65oC 孵育箱中轻轻加热最多 4 分钟，或在此温度下放置在加热块上，然后通过移液器动作混合。如果不溶解还原剂仍然可见 向小瓶中加入 10 µL 纯水并混合。保护标记试剂免受潮湿，并在 60 分钟内使用。

7向样品中添加标记试剂：向每个干燥的聚糖样品中加入 5 µL 标记试剂，盖上微量管，彻底混合，然后轻轻敲击以确保标记溶液位于小瓶底部。

8孵化：将反应瓶放入加热块、沙盘或设置为 65°C 的干燥烘箱中并孵育 3 小时。孵化必须在干燥的环境中进行。使用烤箱或干块 ‑ 请不要使用水浴。样品必须完全溶解在标记溶液中才能有效标记。鼓励完全溶解 样品可以在 65°C 孵育开始后涡旋 30 分钟，然后孵化继续。在大多数情况下，孵育时间可缩短至 2 小时或延长至 4 小时，无需显着改变标记反应的结果。

9离心并冷却：孵育期后取出样品，短暂离心微管，然后让它们冷却完全到室温。

2AB 标记聚糖的分析

2‑AB 标记的聚糖可以通过多种不同的分析方法进行研究，包括HPLC、凝胶电泳和质谱。概述如下。

高效液相色谱分析：2‑AB 标记的聚糖混合物可以通过多种 HPLC（高压液相色谱）方法进行分离和分析

色谱柱是用于纯化和分析的特别强大的工具来自复杂聚糖混合物的标记寡糖。

酶学分析

高纯度、测序级酶（例如外切糖苷酶），适用于 N‑和O‑连接的 标记的聚糖可从许多公司获得。选择糖苷酶时要特别小心，选择那些配方与您的特定应用程序。例如，一些酶和酶缓冲液含有干扰通过某些类型的分析。

质谱和电泳

标记的聚糖也可以通过质谱、电泳和各种类型的光谱进行分析。

参考文献

1 Bigger, JC; Patel, TP; Bruce, JA; Goulding, PN; Charles, SM; Non-selective and efficient fluorescent labeling". Analytical Biochemistry 230: 229‑238

2 Trick, GR; Rudd, PM; Dr. Wing; Prime, SB; Dwek, RA (1996) A Rapid, High-Resolution, High-Performance Liquid Chromatographic Method for Separation of Glycan Mixtures and Analytical Oligosaccharide Profiling". Analytical Bio Chemistry 240: 210‑226

3 Townsend, RR; Lipneunas, PH; Bigger, C. Ventom, A. Parek (1996) Multimodal high performance liquid chromatography of fluorescently labeled oligosaccharides for glycoproteins". Analytical Biochemistry 239: 200‑207

4 Guidelines for High Resolution HPLC Carbohydrate Analysis (

5 Enzyme Selection Guide

6 Guidelines for Glycan Purification

7 Mr. Hardy (1997) Labeling of glycans with the fluorophores 2-aminobenzamide and anthranilic acid in "Techniques in Glycobiology", edited by Townsend, RR and Hotchkiss, AT. Marcel Dekker Inc, New York.

8 TechNote: Analysis of 2‑AB (2‑aminobenzamic acid)-labeled glycans