摘 要 为得到益生芽抱杆菌Bacillus subtilis MA139产芽抱的最佳的培养基，以摇瓶发酵的方法，用P1ackett-Burman设计从l1种原料中筛选出4种对芽抱产量有显著影响的因素，即玉米粉、大豆粉、蛋白胨和MnSO4·H2O，然后针对这4个主要因素，用最陡爬坡试验及中心组合设计优化产芽抱的最佳培养基。结果证明，当培养基的配方为：玉米粉3.17g/L、大豆粉5.80g/L、蛋白胨3.62g/L、MnSO4·H2O1.06g/L、葡萄糖5g/L、尿素3g/L、MgSO4·7H2O1.5g/L和KH2PO43g/L时，MAI39发酵36h细菌总数可以从8.32×108cfu/ml提高到3.10×109cfu/mL，芽抱率达到96%。试验表明，通过统计优化培养条件可有效提高B.subtilis MA139产芽孢的得率。
关键词:枯草芽孢杆菌；发酵；培养基优化；试验设计
抗生素添加剂在动物日粮中广泛使用，但其弊端和危害日益体现出来[1]，而抗生素替代品的微生态制剂在畜牧业已得到应用[2]。微生态制剂常用的细菌是乳酸菌，而芽孢杆菌作为动物肠道的外源菌群，也有广泛应用，它能够改善动物胃肠道的微生态平衡，促进动物生长，提高饲料利用率[3-6]。优良的微生态制剂必须有足够的活菌数量[7]。因此，为了尽量提高产品芽孢的数量，需要对其产芽孢的培养基进行系统优化，以降低生产成本，提高芽孢得率[8]。
芽孢杆菌液体深层发酵培养基的优化一般采用单因子试验以及结合均匀设计和正交设计的方法[9-10]。目前趋向采用统计软件构建高效试验设计来进行微生物培养基的优化，通过对试验结果进行数学模拟和优化，可以简化试验步骤，提高准确性[11-14]。本试验旨在以本试验室分离筛选得到的一株枯草芽孢杆菌MA139为出发菌株，优化产芽孢的最适培养基。
1、材料与方法
1.1、菌株
枯草芽孢杆菌MA139，本实验室自行分离和保存。该菌株经中科院微生物所鉴定，其16S rRNA基因序列在GenBank的登录号为DQ415893。该菌株具有饲用益生菌的应用潜力。
1.2、培养基
1)种子及斜面保存培养基(SC培养基)
成分为葡萄糖5g/L；蛋白胨5g/L；酵母粉1g/L；牛肉膏3g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；MnSO4·H2O 0.005g/L；pH7.0。固体培养基则在液体培养基中添加1.8%的琼脂作为凝固剂。
2)发酵培养基
分别按照Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验设计和中心组合设计的方法来配制。
1.3、试剂和原料
玉米、大豆为市售，粉碎后过2O目筛备用；试验中其他试剂均为分析纯。
1.4、培养条件
1)种子培养条件
250 mL三角瓶装种子培养基5OmL，接斜面活化后的种子一环，37℃，225r/min旋转振荡培养20h。
2)发酵培养条件
250mL三角瓶装发酵培养基5OmL，按照4％的接种量接种后在37℃，225r/min旋转振荡培养36h。
1.5、细菌总数和芽孢总数的测定
平板稀释法计数活菌数。芽孢计数则将稀释液放入8O℃水浴中处理20min后培养计数。
1.6、培养基优化试验设计
1)Plackett-Burman设计
在优化初期利用Plackett-Burman设计法[15]，以葡萄糖(X1)、可溶性淀粉(X2)、玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、(NH4)2SO4(X5)、尿素(X6)、蛋白胨(X7)、MgSO4·7H2O(X8)、KH2PO4(X9)、CaC12(X10)、MnSO4·H2O(X11)等为试验因子，对这11种原料进行全面考察，并将其编码为-1和+1的高低二阶层，其所代表的质量浓度值，见表1。
选用”n=12的Plackett-Burman设计，并加上3个中心点来筛选和探讨11个试验因子对细菌总数和芽孢总数的影响，每个试验结果报告为2个重复试验的平均值，见表2。
|
表1 Plackett-Burman试验设计中各参数的编码值及其质量浓度 g/L
|
|
独立变量
|
编码水平
|
|
-1
|
+1
|
|
葡萄糖(X1)
|
5
|
15
|
|
可溶性淀粉(X2)
|
5
|
15
|
|
玉米粉(X3)
|
5
|
15
|
|
大豆粉(X4)
|
10
|
30
|
|
(NH4)2S04(X5)
|
2
|
6
|
|
尿素(X6)
|
3
|
9
|
|
蛋白胨(X7)
|
5
|
15
|
|
MgS04·7H2O(X8)
|
0.5
|
1.5
|
|
KH2P04(X9)
|
1
|
3
|
|
CaCl2(X10)
|
2
|
6
|
|
MnS04·H2O(X11)
|
0.05
|
0.5
|
2)最陡爬坡试验设计
响应面拟合方程只有在考察的紧接邻域里才充分近似真实结果，故只有在最先逼近最大目标产物产量区域后才能建立有效的响应面拟合方程[16]。以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，从而快速逼近产量最大值。根据Plackett-Burman设计的结果，来确定是否进行最陡爬坡试验。
3)中心组合设计
根据Plackett-Burman设计筛选出的试验因子和最陡爬坡试验确定的逼近浓度，以JMP5.0软件设计中的DOE程序进行中心组合试验，拟合数据得到一个描述因变量(细菌总数)与自变量(培养基组分)关系的二阶经验模型[11-17]：y=bo+ΣbiXi +ΣbijXiXj+ΣbiiX2ii；式中：y为预测响应值，即细菌总数(1g[Ntot(cfu/mL)]；b为回归系数；Xi为自变量的编码水平。用JMP5.0软件对试验数据进行回归拟合，并对拟合方程作显著性检验和方差分析。
2、结果与讨论
2.1、影响芽孢杆菌增殖的重要因素
按照Plackett-Burman试验设计，在发酵36h时取样测定发酵液当中的细菌总数(total number，Ntot)和芽孢总数(spore number，Ns)。Plackett-Burman试验设计结果见表2并对其进行一阶模式回归分析(表3)。细菌总数和芽孢总数2种结果回归分析的检定系数分别为0.96和0.94，说明回归分析能够确切地描述试验数据。根据分析结果，发现对B.subtilis MA139发酵起主要作用有4种原料，即玉米粉、大豆粉、蛋白胨和MnSO4·H2O，并对11种原料成分归纳调整，作为下一步试验分析的依据。质量浓度调整说明见表4。
|
表2 Plackeet-Burman试验设计结果(n=12)
|
|
编号
|
变量水平
|
响应值
|
|
X1
|
X2
|
X3
|
X4
|
X5
|
X6
|
X7
|
X8
|
X9
|
X10
|
X11
|
lg[Ntot/(cfu/ml)]
|
lg[Ns/(cfu/ml)]
|
|
1
|
-1
|
1
|
-1
|
1
|
1
|
-1
|
1
|
-1
|
-1
|
1
|
-1
|
8.69
|
8.48
|
|
2
|
-1
|
-1
|
-1
|
-1
|
1
|
-1
|
1
|
1
|
-1
|
-1
|
1
|
9.37
|
9.35
|
|
3
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
9.01
|
8.99
|
|
4
|
1
|
-1
|
-1
|
1
|
1
|
-1
|
1
|
-1
|
1
|
-1
|
-1
|
8.41
|
8.40
|
|
5
|
-1
|
1
|
1
|
-1
|
1
|
-1
|
-1
|
1
|
1
|
-1
|
-1
|
9.31
|
9.29
|
|
6
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
8.43
|
8.32
|
|
7
|
-1
|
1
|
-1
|
-1
|
-1
|
1
|
1
|
-1
|
1
|
-1
|
1
|
9.25
|
9.24
|
|
8
|
1
|
1
|
-1
|
1
|
-1
|
-1
|
-1
|
1
|
-1
|
-1
|
1
|
9.07
|
9.06
|
|
9
|
-1
|
-1
|
1
|
1
|
-1
|
1
|
1
|
1
|
-1
|
-1
|
-1
|
8.23
|
8.18
|
|
10
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
9.05
|
9.05
|
|
11
|
1
|
1
|
1
|
-1
|
-1
|
-1
|
1
|
-1
|
-1
|
1
|
-1
|
8.30
|
8.26
|
|
12
|
1
|
-1
|
-1
|
-1
|
-1
|
1
|
-1
|
1
|
1
|
1
|
-1
|
9.15
|
9.15
|
|
13
|
-1
|
-1
|
1
|
1
|
-1
|
-1
|
-1
|
-1
|
1
|
1
|
1
|
9.06
|
8.94
|
|
14
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
9.02
|
9.01
|
|
15
|
1
|
-1
|
1
|
-1
|
1
|
1
|
-1
|
-1
|
-1
|
-1
|
1
|
8.79
|
8.74
|
|
表3 Plackeet-Burman试验设计回归分析结果 cfu/L
|
|
截距参数
|
细菌总数Ntot
|
芽孢总数Ns
|
|
参数估计
|
t
|
P
|
参数估计
|
t
|
P
|
|
intercept
|
8.876
|
203.044
|
0.000
|
8.831
|
163.294
|
0.000
|
|
X1
|
-0.147
|
-3.001
|
0.058
|
-0.129
|
-2.136
|
0.122
|
|
X2
|
0.003
|
0.068
|
0.950
|
-0.009
|
-0.152
|
0.889
|
|
X3
|
-0.152
|
-3.103
|
0.053*
|
-0.163
|
-2.688
|
0.075*
|
|
X4
|
-0.190
|
-3.888
|
0.030**
|
-0.221
|
-3.652
|
0.035**
|
|
X5
|
-0.005
|
-0.102
|
0.925
|
-0.021
|
-0.345
|
0.753
|
|
X6
|
-0.082
|
-1.671
|
0.193
|
-0.099
|
-1.640
|
0.200
|
|
X7
|
-0.173
|
-3.547
|
0.038**
|
-0.159
|
-2.633
|
0.078*
|
|
X8
|
0.088
|
1.807
|
0.168
|
0.108
|
1.788
|
0.173
|
|
X9
|
0.097
|
1.978
|
0.142
|
0.106
|
1.750
|
0.178
|
|
X10
|
-0.005
|
-0.102
|
0.925
|
-0.034
|
-0.565
|
0.612
|
|
X11
|
0.157
|
3.205
|
0.049**
|
0.158
|
2.605
|
0.080*
|
|
|
|
P=0.082，RSq=0.96 P=0.125，RSq=0.94
|
注：*为P＜0.1，**＜0.05。
|
表4 Plackeet-Burman试验设计各因子结果的质量浓度分析
|
|
试验因子
|
质量浓度（g/L）
|
说明
|
|
调整前
|
调整后
|
|
葡萄糖(X1)
|
5-15
|
5
|
对细菌总数和芽孢总数为负相关，对细菌总数影响达到显著水平，而对芽孢总数的影响不显著，为了减少试验因子，维持在低水平
|
|
可溶性淀粉(X2)
|
5-15
|
删除
|
无显著影响，可信度大于20%，删除此因子
|
|
玉米粉(X3)
|
5-15
|
1-5
|
负显著，降低筛选浓度
|
|
大豆粉(X4)
|
10-30
|
1-10
|
负极显著，降低筛选浓度
|
|
(NH4)2S04(X5)
|
2-6
|
删除
|
无显著影响，可信度大于20%，删除此因子
|
|
尿素(X6)
|
3-9
|
3
|
不显著，负相关，可信度小于20%，为减少试验因子，维持在低水平
|
|
蛋白胨(X7)
|
5-15
|
1-5
|
负显著，降低筛选浓度
|
|
MgS04·7H2O(X8)
|
0.5-1.5
|
1.5
|
不显著，可信度小于20%，为减少试验因子，维持在高水平
|
|
KH2P04(X9)
|
1-3
|
3
|
不显著，正相关，P值相对较小，维持在高水平
|
|
CaCl2(X10)
|
2-6
|
删除
|
不显著，可信度大于20%，删除此因子
|
|
MnS04·H2O(X11)
|
0.05-0.5
|
0.5-1.5
|
显著，正相关，提高筛选浓度
|
2.2、最陡爬坡试验
选取对 B.subtilis MA139发酵 4种主要原料。对Plackett-Burman试验设计中得到的结果进行t检验，比较中心点水平的平均响应值与试验点处的平均响应值间的差异显著性。试验结果显示，中心点水平与试验点间在a=0．05水平上不显著(P值分别是0.460和0.388)，这就表明本试验设计中选取的中心点水平还没有接近最大的响应区域内，因此还必须进一步寻找中心点值，也就是最陡爬坡试验。
以回归系数最大的大豆粉(X4)为基准，以每次减少浓度1%为基本步长(△)。处理5中的细菌总数和芽孢总数达到了最高，这一结果表明，处理5的玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、蛋白胨(X7)、MnSO4·H20(X11)这4种物质浓度已在最优点附近，可以此浓度为中心点采用中心组合设计来对培养基作进一步的优化(表5)。而且在Plackett-Burman设计及最陡爬坡试验中，细菌总数与芽孢总数的分析结果一致，故在以下的中心组合设计仅以发酵液的细菌总数作为考察目标。
|
表5 最陡爬坡试验设计及其结果
|
|
处理序号
|
培养基成分/（g/L）
|
结果
|
|
玉米粉（X3）
|
大豆粉（X4）
|
蛋白胨（X7）
|
MnSO4·H20（X11）
|
lg[Ntot/(cfu/ml)]
|
lg[Ns/(cfu/ml)]
|
|
1
|
5.00
|
10.00
|
5.00
|
0.50
|
9.33
|
9.28
|
|
2
|
4.52
|
9.00
|
4.52
|
0.61
|
9.37
|
9.30
|
|
3
|
4.08
|
8.00
|
4.08
|
0.72
|
9.13
|
9.12
|
|
4
|
3.64
|
7.00
|
3.64
|
0.83
|
9.34
|
9.29
|
|
5
|
3.20
|
6.00
|
3.20
|
0.94
|
9.43
|
9.40
|
|
6
|
2.76
|
5.00
|
2.76
|
1.05
|
9.39
|
9.34
|
|
7
|
2.32
|
4.00
|
2.32
|
1.16
|
9.10
|
9.01
|
|
8
|
1.88
|
3.00
|
1.88
|
1.27
|
9.17
|
9.15
|
|
9
|
1.44
|
2.00
|
1.44
|
1.38
|
9.06
|
8.95
|
|
10
|
1.00
|
1.00
|
1.00
|
1.50
|
8.91
|
8.84
|
2.3、中心组合设计
以最陡爬坡试验中处理5的玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、蛋白胨(X7)、MnSO4·H2O(X11)的浓度为中心点进行优化，选择中心试验点为3，星号臂长γ=1.547。各自变量水平见表6，试验设计及结果见表7。
分析结果表明(表8)，模型极显著(P＜0.01)，并且有很好的确定系数，RSq=0.93。这表明B.subtilis MA139细菌总数93%的可靠性可由模型来预测。并可以通过回归分析结果得出试验模型：
y=9.434-0.003X3-0.025X4+0.028X7-0.013X11-0.006X3X4-0.02X3X7-0.009X4X7-0.012X3X11-0.026X4X11-0.03X7Xll-0.068X3X3-0.013X4X4-0.043X7X7-0.025X11X11
自变量前的数值为回归模型对应项的 P值。
根据JMP模型的分析结果以及二次回归方程可以得出，此模型具有最大响应值，极值分析结果见表9。根据结果换算成4个主因素的实际浓度值，即玉米粉3.17g/L，大豆粉5.80g/L，蛋白胨3.62g/L，MnSO4·H2O1.06g/L。采用优化出的培养基，芽孢杆菌最终细菌浓度预测值为2.84×109cfu/mL。
为了检验模型预测的准确性，采用优化的培养基重复试验3次，发酵液当中平均细菌数为 2.91×l09cfu/mL，这表明实验值和实际值之间具有良好的拟合性，优化模型可靠。
|
表6 中心组合设计各因子及其编码值 g/L
|
|
独立变量
|
编码水平
|
|
-1.547
|
-1
|
0
|
1
|
1.547
|
|
玉米粉（X3）
|
1.65
|
2.20
|
3.20
|
4.20
|
4.75
|
|
大豆粉（X4）
|
4.45
|
5.00
|
6.00
|
7.00
|
7.55
|
|
蛋白胨（X7）
|
1.65
|
2.20
|
3.20
|
4.20
|
4.75
|
|
MnSO4·H20（X11）
|
0.55
|
0.69
|
0.94
|
1.19
|
1.32
|
|
表7 中心组合设计及其结果
|
|
编号
|
变量水平
|
lg[Ns/(cfu/ml)]
|
|
编号
|
变量水平
|
lg[Ns/(cfu/ml)]
|
|
X3
|
X4
|
X7
|
X11
|
X3
|
X4
|
X7
|
X11
|
|
1
|
-1
|
-1
|
1
|
1
|
9.36
|
15
|
-1
|
1
|
1
|
-1
|
9.39
|
|
2
|
-1
|
-1
|
1
|
-1
|
9.36
|
16
|
-1
|
1
|
-1
|
1
|
9.27
|
|
3
|
1.547
|
0
|
0
|
0
|
9.28
|
17
|
1
|
-1
|
-1
|
-1
|
9.24
|
|
4
|
-1.547
|
0
|
0
|
0
|
9.27
|
18
|
1
|
1
|
-1
|
-1
|
9.31
|
|
5
|
0
|
0
|
0
|
1.547
|
9.34
|
19
|
0
|
0
|
-1.547
|
0
|
9.30
|
|
6
|
-1
|
1
|
1
|
1
|
9.23
|
20
|
0
|
-1.547
|
0
|
0
|
9.46
|
|
7
|
1
|
1
|
1
|
-1
|
9.30
|
21
|
-1
|
-1
|
-1
|
1
|
9.29
|
|
8
|
-1
|
-1
|
-1
|
-1
|
9.20
|
22
|
0
|
0
|
1.547
|
0
|
9.37
|
|
9
|
0
|
0
|
0
|
0
|
9.42
|
23
|
0
|
0
|
0
|
0
|
9.44
|
|
10
|
0
|
0
|
0
|
0
|
9.43
|
24
|
-1
|
1
|
-1
|
-1
|
9.20
|
|
11
|
1
|
-1
|
1
|
1
|
9.29
|
25
|
0
|
1.547
|
0
|
0
|
9.34
|
|
12
|
1
|
1
|
1
|
1
|
9.20
|
26
|
0
|
0
|
0
|
-1.547
|
9.41
|
|
13
|
1
|
-1
|
-1
|
1
|
9.34
|
27
|
1
|
-1
|
1
|
-1
|
9.36
|
|
14
|
1
|
1
|
-1
|
1
|
9.20
|
|
|
|
|
|
|
|
表8 中心组合设计(CCD)回归分析结果
|
|
回归系数
|
参数估计
|
标准差
|
t
|
P
|
|
回归系数
|
参数估计
|
标准差
|
t
|
P
|
|
Intercept
|
9.434
|
0.015
|
638.810
|
0.000
|
Intercept
|
9.434
|
0.015
|
638.810
|
0.000
|
|
X3
|
-0.003
|
0.007
|
-0.391
|
0.702
|
X3X11
|
-0.012
|
0.007
|
-1.635
|
0.128
|
|
X4
|
-0.025
|
0.007
|
-3.860
|
0.002
|
X4X11
|
-0.026
|
0.007
|
-3.491
|
0.004
|
|
X7
|
0.028
|
0.007
|
4.282
|
0.001
|
X7X11
|
-0.030
|
0.007
|
-4.067
|
0.002
|
|
X11
|
-0.013
|
0.007
|
-1.961
|
0.074
|
X3X3
|
-0.068
|
0.009
|
-7.672
|
0.000
|
|
X3X4
|
-0.006
|
0.007
|
-0.855
|
0.409
|
X4X4
|
-0.013
|
0.009
|
-1.522
|
0.154
|
|
X3X7
|
-0.020
|
0.007
|
-2.615
|
0.023
|
X7X7
|
-0.043
|
0.009
|
-4.891
|
0.000
|
|
X4X7
|
-0.009
|
0.007
|
-1.257
|
0.233
|
X11X11
|
-0.025
|
0.009
|
-2.805
|
0.016
|
|
表9 响应面极值分析
|
|
临界值
|
估计值
|
细菌总数Nt/(cfu/ml)
|
稳定点模型
|
|
X3
|
X4
|
X7
|
X11
|
|
-0.03
|
-1.2
|
0.42
|
0.12
|
9.454
|
2.84×109
|
最大值
|
2.4、优化结果验证
采用优化后的培养基与起始的种子培养基进行对照，并对培养条件进行优化，结果表明，优化后的培养基提高了各阶段细菌总数的数量，在36h时，优化后培养基可以使细菌总数从 8.32×108cfu/mL提高到3.10×109cfu/mL，并且在36h时，芽孢率可以达到96%。
3、结论
通过 Plackett Burman设计、最陡爬坡试验及中心组合设计的方法确定了B.subtilis MA139发酵培养的最适培养基。优化后B.subtilis MA139的细菌浓度为3.10×109cfu/mL，芽孢率达到96%从而有效的提高了单位产芽孢的数量