蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术。它利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来分离指定样品中包含的各种蛋白质，将分离的蛋白质转移到固相载体（例如PVDF膜或硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。通过分析特定反应的位置和强度，可以获得目标蛋白在给定细胞或组织匀浆中的表达信息。由于凝胶电泳的高分辨率和免疫的强特异性和高灵敏度，WB可检测低至1ng的靶蛋白。该方法广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫遗传学等研究领域。
实验步骤
蛋白样品制备
（1）准备溶液：室温融解蛋白裂解液RIPA，加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，混匀后立即放置在冰上。
（2）不同类型样本处理：
对于贴壁细胞：4℃预冷的PBS洗2~3遍，用细胞刮子刮下细胞，或用胰蛋白酶处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
对于悬浮细胞：用PBS洗2~3遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
对于组织样品：剪取适量组织和适量混匀的蛋白裂解液于匀浆器中磨匀（0.01g组织加上50-100μL的蛋白裂解液），直至看不见组织块。
（3）裂解：细胞样品按1×106细胞数加100 μL裂解液，冰上裂解30min （或冰上裂解5 min，超声仪冰浴超声20s）。组织样品转移匀浆液于1.5mL EP管中，置于冰上裂解15min。
（4）抽提：12,000rpm, 4℃离心10min，立即吸取上清至一预冷的1.5mL EP管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。
BCA蛋白浓度测定
原理：
Cu2+在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成Cu+，Cu+和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个Cu+，形成紫色的反应复合物。该水溶性复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系。因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。
实验步骤：
（1）制备好BSA标准品，并将BCA试剂A液: B液=50:1配制适量BCA工作液，样品用预冷PBS进行稀释。
（2）将20µL梯度浓度的标准品和待测样品分别加到96孔板中，每个测定要做3个平行对照。
（3）各孔加入200µL BCA工作液，37℃孵育30min。
（4）酶标仪562nm波长读取各孔OD值。
（5）制作标准曲线，从标准曲线中求出待测样品浓度。
制胶（用预制胶可省略）
（1）准备干净的玻璃板，将玻璃板压入架子上，观察底部的胶垫是否与玻璃板结合紧密。防止胶液漏出。
（2）配置不同比例的分离胶，加入适量的分离胶，距离上端边缘1.5cm左右即可，为浓缩胶中梳子的插入留有空间。之后加入异丙醇压平液面，待分离胶凝固之后倒掉异丙醇，并用纸巾吸干玻璃板缝隙间的异丙醇。
（3）配置浓缩胶，加入浓缩胶并迅速插入不同孔数的梳子，注意插梳子时将梳子从一侧插入，再平滑到另一侧，小心气泡的产生。
（4）待浓缩胶凝固之后，将玻璃板从架子上取下，用纸巾包裹并用水打湿并置于塑料袋中防止凝胶边干，最后放在-4℃冰箱备用。
SDS-PAGE电泳
制样
在上述抽提蛋白离心管中加入4×上样缓冲液混匀，100℃放置10min，迅速冰浴冷却。待冷却之后可放置在-20℃冰箱中长期保存备用。
上样电泳
（1）双手从两端同时将梳子拔出，防止梳子受力不匀而使胶孔变形。
（2）根据BCA测定结果，目的蛋白每孔上样量20μg-40μg，内参蛋白每孔上样量5μg-10μg；将蛋白样品涡旋混匀后加入到胶孔中，并在样品两侧的孔内加入适宜的蛋白Marker。
（3）初始浓缩胶恒压为80V，待溴酚蓝进入分离胶后，Marker的条带肉眼可见分开时，调节恒压为120V，直至溴酚蓝到分离胶的底部停止电泳。
转膜（以湿转为例）
原理：
PVDF膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起；PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固；PVDF膜在使用时需预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。
实验步骤
（1）准备转膜缓冲液：提前配制好转移缓冲液并预冷至4℃。
（2）准备PVDF膜和滤纸：将PVDF膜在甲醇中浸泡30s（从不透明变为半透明），接着用ddH2O冲洗膜表面，最后将膜和滤纸放入转膜缓冲液中。
（3）处理凝胶：轻轻撬开玻璃板，根据Marker判断目的蛋白的大致位置，切除多余的胶块。将凝胶放入转膜缓冲液中，确保胶的完整性。
（4）制备转膜“三明治”：三明治夹套的黑色面向下，透明面（或红色面）朝上打开放置在干净的桌面上。从下依次往上放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵。确保每一层之间都没有气泡，可以在放置最上层泡沫垫前使用滚轮轻轻滚动，以去除气泡。
（5）转膜后处理：冰浴条件下放入转膜装置，确保在低温下转膜。电流设定为100V恒压，时间设定为1h。完成以后取出PVDF膜观察转膜效果，如转膜成功，则膜上有明显蛋白Marker痕迹。用TBST冲洗膜表面，进行封闭等后续步骤。
封闭
将转膜得到的PVDF膜泡在TBST中保持湿润，倒掉TBST后，将转好的膜于摇床上用5%的脱脂牛奶（TBST配制），磷酸化蛋白检测用5%的BSA（TBST配制）缓冲液，置于摇床40rpm室温孵育45min-1h。
注：封闭液的主要作用是占据非目标结合位点，降低背景信号，从而提高检测的特异性和灵敏度。
抗体孵育
（1）封闭后洗膜：按照3次TBST进行洗膜，每次10min，80-100rpm。
（2）孵育一抗：稀释一抗（TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5% BSA），4℃过夜孵育。待测蛋白质能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物。
（3）洗膜：按照3次TBST进行洗膜，每次10min，80-100rpm。清洗除去未结合目标蛋白的的一抗。
（4）孵育二抗：用一抗处理过的PVDF膜再用标记的二抗处理，带有标记（HRP辣根过氧化物酶）的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。一般使用TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5% BSA室温孵育1-2h。
（5）洗膜：按照3次TBST进行洗膜，每次10min，80-100rpm。
显影及成像分析
原理：
WB显影液的显影原理是基于酶促反应的原理，通过酶标记的二抗和显色底物的配合使用（二抗中的辣根过氧化物酶催化过氧化氢，底物被氧化产生发光效应），可将蛋白质在膜上的位置可视化，从而帮助了解蛋白质的表达和功能。
实验步骤
用酒精擦拭操作台，按比例配置曝光液，现用现配，用锡纸包裹避光。用纸巾吸干PVDF膜表面多余的水分，在膜表面覆盖一层曝光液。之后进行凝胶图象分析，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
【免责声明】发布内容来源于互联网、业内人士投稿以及微信公众号等公开资源，我们对文中观点持中立态度，文中观点不代表本平台的立场。所有文章仅供读者参考和交流使用。转载的文章版权归原作者所有，如有侵权行为，请及时与我们联系以便删除。