产品名称：辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒
产品英文名： CoenzymeⅠNAD(H) Content Assay Kit
简要介绍：
辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
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产品内容：
酸性提取液：15mL×1 瓶，4℃保存；
碱性提取液：15mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃保存
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存，用时加入 6.1mL 双蒸水，混匀，4℃保存一周；
试剂四：粉剂×1 瓶，4 ℃保存，用时加入 6.6mL 双蒸水，混匀，4℃保存一周；
试剂五：液体 3mL×1 瓶，4 ℃保存；
试剂六：液体 40mL×1 瓶，4 ℃保存；
试剂七：自备，将 72mL 乙醇和 3mL 蒸馏水充分混合备用。
NAD 标准品：粉剂×1 支，-20℃保存。临用前加入 1.5mL 蒸馏水，即 2umol/mL，将其稀释为 1.25nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用。
NADH 标准品：粉剂×1 支，-20℃保存。临用前加入 1.4mL 蒸馏水，即 2umol/mL，将其稀释为 1.25nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用。
操作步骤：
一、NAD+和 NADH 的提取：
1、血清（浆）中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 酸性提取液，煮沸 5min (盖紧，以防止水分 散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min；取上清 200uL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上保存待测。
NADH 的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 碱性提取液，煮沸 5min(盖紧，以防止水分 散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200uL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。
2、组织中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防 止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200uL，加入等体积碱性提取液混匀， 10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。
NADH 的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防 止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200uL，加入等体积酸性提取液混匀， 10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。
3、细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 酸性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％ 或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200uL 另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃ 离心 10min，取上清,冰上保存待测。
NADH 的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 碱性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％ 或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200uL 另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃ 离心 10min，取上清,冰上保存待测。
二、测定步骤：
1、 分光光度计预热30分钟以上，调节波长570nm，蒸馏水调零。
2、 操作表（在1.5ml棕色EP管中按下表依次加样）
| 试剂名称 |
对照管(µL) |
测定管(µL) |
NAD 或 NADH 标准管 |
空白管 |
| 上清液 |
50 |
50 |
|
|
| 标准溶液 |
|
|
50 |
|
| 蒸馏水 |
|
|
|
50 |
| 试剂六 |
500 |
|
|
|
| 试剂一 |
250 |
250 |
250 |
250 |
| 试剂二 |
75 |
75 |
75 |
75 |
| 试剂三 |
75 |
75 |
75 |
75 |
| 试剂四 |
75 |
75 |
75 |
75 |
| 试剂五 |
35 |
35 |
35 |
35 |
| 充分混匀，室温避光静置20min |
| 试剂六 |
|
500 |
500 |
500 |
| 充分混匀，静置5min后，15000rpm，25℃离心15min，弃上清，沉淀中加入： |
| 试剂七 |
1000 |
1000 |
1000 |
1000 |
混匀， 570nm 下比色，读取吸光值ΔA 测定=A 测定管-A 对照管，NAD 标准管的记为ΔA 标准 1=A 标准管 1-A 空白管。 NADH 标准管的记为ΔA 标准 2=A 标准管 2-A 空白管。空白管只需做一 到两次。
注意事项：
1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三和四混合后再加，必须分开加。
2、反应过程要注意避光。
3、当吸光值大于 1 时，建议稀释后测量，计算公式中应当乘以稀释倍数。
NAD+含量的计算
- 血清（浆）中 NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷V 血清=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1
2、组织、细菌、细胞中 NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷(V 提取×Cpr) = 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1
(2)按样本鲜重计算
NAD+ (nmol/g 鲜重）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷W= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NAD+ (nmol/10 4cell）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 1
NADH 含量的计算
- 血清（浆）中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷V 血清 =12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2
2、组织中 NADH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷(V 样品×Cpr) = 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2
(2)按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷W=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/10 4cell）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 C 标：NAD 或 NADH 标准溶液的浓度，1.25nmol/mL；V 提取：加入提取液总体积，1mL；V 血清：提取时加入的血清体积，0.1mL；W：样本鲜重，g；500：500 万个细胞。