氮哌酮的危害及检测目的
氮哌酮是一种丁酰苯类神经安定药，动物使用后可消除紧张感，使其活动力下降，对环境淡漠并长期处于安静状态。有助于降低因应激及创伤引起的死亡率，因此在长途运输中常常给猪等动物使用该药。氮哌醇是氮哌酮在动物体内的代谢产物，与原药氮哌酮的化学结构相近，是氮哌酮的残留标示物。通过食物链氮哌酮及其代谢产物氮哌醇会对人体产生直接的危害。为此我国农业农村部和国家市场监督管理总局2019年发布的GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中明确规定了氮哌酮及其残留标示物氮哌醇在猪靶组织中的残留限量。
本文阐述了如何将氮哌酮及其代谢物从样品基质中分离提取出来，并经过净化后，转化成高效液相色谱可以检测的形式。以提取、净化为重点，依据国标GB 29709-2013，为检测人员和相关领域研究人员提供一定的参考。
检测项目：氮哌酮、氮哌醇
应用范围：猪的肌肉、皮+脂、肝脏和肾脏
高效液相色谱法
方法原理：试样中残留的氮哌酮和氮哌醇用乙腈萃取，正己烷除脂，MCX柱净化，高效液相色谱测定，外标法定量。
前处理仪器：
分析天平（感量0.01 g 和0.00001 g）；冷冻高速离心机；氮吹仪；旋涡混合器；固相萃取装置；超声波清洗机；均质机；离心管；滤膜（0.2 μm）。
检测仪器：HPLC +PDA
样品的制备与保存
取新鲜或冷冻空白组织、供试组织，去除筋膜，绞碎，并使均质。
取均质后的供试样品，作为供试试料。
取均质后的空白样品，作为空白试料。
取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
试料于零下20 ℃ 以下保存。
前处理方法
1.提取
称取试样5 g±0.05 g，于离心管中，加乙腈10 mL，旋涡混合1 min，超声2 min，5000 r/min离心5 min，取上清液，残渣中加乙腈10 mL重复提取一次，合并两次上清液。于40 ℃水浴旋转蒸干。用2 %甲酸水溶液5 mL溶解残余物，加正己烷4 mL，混匀，5000 r/min离心5 min，弃正己烷层液，备用。
2.净化
MCX柱依次用甲醇3 mL、水3 mL和2 %甲酸水溶液3 mL活化，取备用液过柱，控制流速小于1 mL/min，用2 %甲酸水3 mL和甲醇3 mL淋洗，抽干，用5 %氨化甲醇4 mL洗脱。收集洗脱液，于40 ℃氮气吹干，用流动相（乙腈-乙酸铵溶液1+1）1.0 mL溶解残余物，旋涡混匀，供高效液相色谱法测定。
国标解读及注意事项
1.氮哌酮和氮哌醇标准物质用甲醇配成1 mg/mL的标准储备液，在零下20 ℃ 以下避光保存，有效期3 个月。
2.本方法使用乙腈两次提取目标化合物，正己烷除脂，阳离子交换柱富集净化，相当于5 g试料进行上机检测。
3.MCX柱净化方法为“酸上样，碱洗脱”。
4.氨水甲醇溶液现用现配，避免氨水挥发，影响洗脱效果；洗脱过程中洗脱溶剂少量多次加入，可以增加洗脱率。
5.固相萃取过程中需要控制流速，使溶液一滴一滴地流下，以保证离子交换的效果。