中华人民共和国国家标准
公共场所茶具微生物检验方法 大 肠 菌 群 测 定 GB/T 18204.3-2000
Methods of microbiological examination for tea set in public places
- D et er m in at ion o f C ol ifo rm bacteria
1 范围
本标准规定了公共场所茶具大肠菌群的测定方法。
本标准适用于公共场所内公用茶具大肠菌群的测定。
2 定义
本标准采用下列定义。
大肠菌群coliform bacteria
指一群在37`C,24 h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价被检物的卫生质量。
3 仪器
3.1 高压蒸汽灭菌器。
3.2 干热灭菌箱。
3.3 培养箱:36℃士I'C。
3.4 水箱。
3.5 电炉。
3.6 天平。
3.7 灭菌平皿:直径9 Cm,
3.8 灭菌刻度吸管:1 ML，10 ML,
3.9 灭菌棉拭子。
3.10 灭菌剪刀。
3.11 PH计或精密PH试纸。
4 培养基和试荆
4. 1 乳搪胆盐发酵培养液
4.1.1 成分:蛋白胨 20 g
猪 胆 盐 ( 或牛 、 羊 胆 盐 ) 5g
乳 糖 10g
0.04 % 嗅 甲 酚 紫 水 溶 液 25 mL
蒸 馏 水 1 000 mL
4.1.2 制法:将蛋白脉、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH至7.4,加澳甲酚紫溶液，混匀，分装到带有倒管的试管中，每管10 mL。以115 `C高压灭菌15 min。
注 :双 料 乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
4.2 伊红美蓝琼脂
4.2.1成分:蛋白胨 10g
乳 搪 10 g
磷 酸 氢 二 钾 2 g
琼脂 1 7g
2% 伊 红 水 溶 液 20m L
0. 65 % 美 蓝 溶 液 10 m L
蒸 馏 水 1 0 0 0m L
4.2.2 制法:将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调pH至7.1，分装到烧瓶内。121`C高压灭菌15 min备用，临用时加人乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55`C，加人伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
4.3 乳糖发酵管
4.3. 1 成分;蛋白胨 20 g
乳糖 1 0g
0. 04 % 澳 甲 酚 紫 水 溶 液 25 m L
燕 馏 水 1 0 0 0m L
4.3.2 制法:将蛋白陈及乳糖溶于水中，调pH 至7.4，加人指示剂，分装到带有倒管试管中，每管3 mL,115 C高压灭菌15 min,
4.4 革兰氏染色液
4.4.1 结晶紫染色液:
结 晶 紫 1g
95 % 乙 醇 20 m L
1%草 酸 钱 水 溶 液 80 m L
将 结 晶 紫溶于乙醇中，然后与草酸钱溶液混合。
4.4.2 革兰氏碘液:
碘 1g
碘 化 钾 2g
蒸 馏 水 30 0m 1
将 碘 与 碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300m L,
4.4.3 脱色液:
95 % 乙 醇
4.4.4 沙黄复染液:
沙 黄 0.2 5g
95 % 乙 醇 10 m L
蒸 馏 水 90 m L
将 沙 黄 溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
4.5 染色法
4.5.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1 min，水洗。
4.5.2 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。
4.5.3 滴加95%乙醇脱色，约30 s，水洗。
4. 5.4 滴加复染液，复染1 min，水洗，待干，镜检。
4.6 染色结果
革 兰 氏 阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
4.7 大肠菌群快速检验纸片
4.7.1质量要求:纸片必须符合食(饮)具用大肠菌群快速检验纸片质量标准。
4.7.2 质量标准:每张纸片5 cm X5 cm,pH值7. 0-7.4，包装无菌，生产厂家经卫生部门审核认可。
5 检验程序
大肠菌群检验程序如下:
6 操作步骤
6.1 采样方法
6.1.1 随机法:随机抽取清洗消毒后准备使用的茶具
6.1.2 涂抹法:使用测定细菌总数时采集的样品，无需重采。
6.1.3 纸片法:用灭菌生理盐水湿润5 cm X5 cm大肠菌群快速测定纸片两张，分别粘贴在茶具内、外缘口唇接触处，约30 s后取下，置于无菌塑料袋内。
6.2 检验方法
6.2.1 发酵法
6.2.1.1 用测定细菌总数剩余的检样，倒人双料乳糖胆盐发酵培养液中。置36℃±1'C培养箱内培养24 h,
6.2.1.2 观察是否产酸、产气，若有变黄和气体产生，该管推测性检验阳性。
6.2.1.3如不产酸、不产气则为大肠菌群阴性。
6.2.1.4 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，转种伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1'C培养箱培养18-24 h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实性试验。
6.2.1.5 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行染色镜检;同时接种乳糖发酵管，置36℃±1'C培养24 h。
6.2.2 纸片法
将 已 采 样的纸片置36℃士1'C培养箱内培养16^-18h ，观察结果。
7 结果报告
7.1 发酵法
凡 乳 糖 发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告检出大肠菌群。
7.2 纸片法
纸 片 保 持紫蓝色不变，则报告为大肠菌群阴性;纸片变黄，并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕，则报告检出大肠菌群。