样本研磨我们一般用到三种方法: 第一种:将研钵置于冰盒上匀浆即冰浴匀浆,在匀浆的过程中注意匀浆器浸于冰中,防止因为摩擦引起的温度过高,提取液可以在匀浆过程中或者匀浆后加入。 第二种:用液氮匀浆,液氮研磨前将样本洗净,尽量剪成小块,放入研钵中,加入液氮研磨,液氮挥散后尽快加入第二次液氮直至研磨成粉末状,避免其过程中 反复冻融,同时要做好保护措施,防止冻伤手指。完成后将粉末收集到离心管中加入缓冲液。样本可以提前称量号也可研磨完后称量。 第三种:使用匀浆机进行匀浆,将称好的组织放入离心管中,加入适量提取液,加入钢珠。并将模块提前遇冷,按照机器指示进行操作。一般的动物组织用 该方法效果尚可,有些机器对植物组织的处理效果不好。
使用分光光度计的用户,用蒸馏水或相应的有机试剂直接调零。使用酶标仪的用户,可以在一个孔里加入200μL的蒸馏水或去离子水,作为调零孔, 也可不用调零,后续计算中会有空白孔。
样本测定值若超出检测范围,可以将提取的上清液用提取液稀释后重新测定。一般从高到低,按照2倍,5倍,10倍,20倍的顺序,选择一个合适的稀释 倍数。样本测定值若低于检测范围,可以提高样本浓度,如称取0.2g样本加入1mL提取液匀浆,相当于将样本浓缩2倍。
(1)根据说明书中指定测定温度,提前打开保温设备(如水浴锅),设到指定温度,在达到指定温度后,把冷藏的试剂转移到保温设备中保温10-30分钟以上,以保证反应一开始,就在指定温度中进行。 (2)对于拥有酶标仪的用户,直接提前预热,在达到设定温度后,可以直接把预热后的试剂,加入酶标板,然后开始反应。 (3)在保温设备(水浴锅和金属浴,最好是前者)进行。注意提前对保温设备进行预热,达到设定温度后再进行反应。但是仅适用于能够终止的反应。 (4)对于瞬间完成的反应,或者对温度不敏感的反应,为了提高重复性,最好在同一温度下完成检测。例如打开空调,设定在室温,如25℃。 当然,所有控温设备,都要进行预热。
(1)50管的试剂盒,常量法试剂盒,用分光光度计检测。1mL的比色皿检测。 (2)100管的试剂盒,微量法试剂盒,用酶标仪(酶标板)或者分光光度计(0.25 mL比色皿)检测。
(1)50T/48S:50T指能够做50次测定,48S指可以测试48个样品。如果每个样品重复测定3次,那么只能测定16个样品。其中有2次测定用于空白管或者 对照管。值得特别注意的是,50T/24S中由于每个样品测定都需要做对照,因此能够测定样品的数量仅为8个(假设做3次重复) (2)100T/96S:100T指能够做100次测定,96S指可以测定96个样品,如果每个样品重复测定3次,那么只能测定32个样品。其中有4次测定用于空白管或 者对照管。 注意由于瓶璧和移液器吸附等,通常要比理论测定次数少1~3次。其它规格的含义依次类推。值得特别注意的是,100T/48S中由于每个样品测 定都需要做对照,因此能够测定样品的数量仅为16个(假设做3次重复)。
一般试剂为粉剂的,可能更多的考虑到配成溶液后的稳定性差,如NADH,或者和其他试剂溶解在一起会在不同的温度下有其他的化学反应如氯化锰。 -20℃保存的粉剂建议溶解后分装保存,避免反复冻融。