核酸电泳工作流程-5大主要步骤

2022/11/25 17:31:18  作者:阿拉丁生化


 凝胶电泳是许多分子生物学实验的重要部分。建立核酸电泳需采取一系列步骤来实现核酸样品的最佳分离和分析。核酸凝胶电泳工作流程中的关键步骤包括:

 

1.选择和制备凝胶

a.琼脂糖凝胶 b.聚丙烯酰胺凝胶 c.凝胶制备中的缓冲液选择

2.准备标准品和样品

a.核酸梯度选择 b.样品和梯度准备 c.加载染料和缓冲液选择

3.运行电泳

a.电泳缓冲选择 b.电压 c.电泳时间

4.在凝胶中可视化样品

a.荧光染色 b.紫外阴影

5.记录凝胶

a.荧光成像 b.射线自显迹法

图1.核酸凝胶电泳的5大关键步骤。

 

1.选择和制备凝胶 

琼脂糖(9012-36-6)和聚丙烯酰胺(9003-05-8)是核酸分离中最常用的两种凝胶基质。两种材料都是三维基质,孔径大小适合核酸分离,且与样品间无反应。可通过改变基质的百分比来调整孔径大小,从而有效分离不同大小的核酸。

 

有关琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺之间的选择,主要取决于核酸样品的大小和所希望达到的分辨率,虽然凝胶灌制和样品回收的方法也可考虑(表1)。琼脂糖凝胶的孔径大小非常理想,可分离0.1-25 kb范围内的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔径较小,可用于分离小于1 kb的核酸分子。某些情况下,可采用聚丙烯酰胺凝胶以获得片段小于100bp的单碱基分辨率[1]

 

表1.琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶之间的差异

 

 

 

琼脂糖

 

 

聚丙烯酰胺

 

 

来源

 

 

来源于海藻的多糖聚合物

 

 

丙烯酰胺交联,甲叉双丙烯酰胺

 

 

凝胶灌制方法

 

 

融化和凝固

 

 

开始化学反应

 

 

核酸回收

 

 

融化和凝固

 

 

溶解和扩散,或电解

 

 

DNA分离范围

 

 

50-50,000 bp

 

 

5-3,000 bp

 

 

分辨力

 

 

5-10核苷酸

 

 

单核苷酸

 

 

a.琼脂糖凝胶

关于凝胶制备,琼脂糖凝胶通常以粉末形式提供,近年来也有方便的预称重片可供使用。为简化工作流程、节省时间,可考虑预制琼脂糖凝胶,其在某些 市售系统中作为集成单元来运行、可视化和分析。

制备您自己的琼脂糖凝胶,凝胶比例计算为:

凝胶%(w/v)=(琼脂糖g/缓冲液ml)x 100%

 

凝胶灌制时,如果使用了荧光核酸染色剂(溴化乙锭1239-45-8),可在凝胶灌制时加入推荐浓度(例如,溴化乙锭0.5 μg/mL)。

 

表2为不同长度的DNA片段分离提供了推荐的琼脂糖凝胶百分比[2]。一般而言,较高比例的凝胶便于更小片段、更好的分离和分辨(图2)。注意,低比例凝胶十分脆弱且难以操作,而高比例凝胶则较浑浊,且会干扰可视化。

 

表2.推荐百分比琼脂糖凝胶用于DNA片段分离。

凝胶百分比

高效分离的范围(bp)

 

 

0.5

 

 

2,000–50,000

 

 

0.6

 

 

1,000–20,000

 

 

0.7

 

 

800–12,000

 

 

0.8

 

 

800–10,000

 

 

0.9

 

 

600–10,000

 

 

1.0

 

 

400–8,000

 

 

1.2

 

 

300–7,000

 

 

1.5

 

 

200–3,000

 

 

2.0

 

 

100–2,000

 

 

3.0

 

 

25–1,000

 

 

4.0

 

 

10–500

 

 

5.0

 

 

10–300

 

 

 

图2.不同百分比的琼脂糖凝胶中DNA片段的流动性。在相同条件下(包括运行时间),在1%、2%和3%琼脂糖凝胶上分离出相同的DNA阶梯。1kb片段用红色星号表示,以供比较。

 

琼脂糖成分

琼脂糖是一种经过纯化的琼脂,是海洋红藻细胞壁的碳水化合物结构组成部分。 琼脂糖是一种分子量约为12万的无支链(线性)聚合物,含有800-1000个单糖。 琼脂糖链由一种重复的异二糖-即-D-半乳糖和3,6-酐-α-L-半乳糖通过1-4糖苷键结合而成。 双糖单位,也称琼脂二糖,通过a-1、3连接形成了一个链(图3)。

图3.琼脂糖的结构单元。琼脂糖由400-500个琼脂二糖单位组成。

 

琼脂糖溶液加热并冷却后,就会形成凝胶基质。其孔洞直径从50到200纳米不等,由凝胶浓度控制。温度高于90℃,琼脂糖便会融化,变成无规卷曲。冷却后,两个琼脂糖链形成由氢键连接的螺旋纤维。进一步冷却至胶凝固点以下(通常小于40°C),则会有更多氢键连接形成螺旋束网络,进而形成具有三维网格的凝胶(图4)[3,4]。 由于氢键,琼脂糖形成的凝胶加热可逆。因此,通过溶解含有目的片段的凝胶,可提取电泳分离出的核酸。

图4.通过加热和冷却改变溶液中琼脂糖的结构。

 

对大于10kbp DNA的提取,低熔点(LMP)的琼脂糖是较合适的选择。LMP琼脂糖在65度左右(1%的凝胶)融化—相对较低的温度,确保可以温和地提取凝胶中完整的核酸大分子。 LMP琼脂糖的低凝胶温度(~25°C)使其成为凝胶内酶反应的理想选择(例如,连接)。酶在半固态的琼脂溶液中处于活跃状态。

 

b.聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺-丙烯酰胺和交联剂—双丙烯酰胺(简称为“bis”)的组分-可以粉末形式提供,但为了方便通常预先制备成原液。该粉末和液体形式是为大家所知的神经毒素,应使用实验室防护性设施,小心操作。在凝胶中,丙烯酰胺和双丙烯酰胺(以%T表示)的总浓度决定了孔隙大小—通常直径为20-150纳米。百分比越高,孔隙越小,可分辨的分子也更小。表3展示了常用的凝胶比例[2]

 

表3.用于分离核酸片段的聚丙烯酰胺凝胶的推荐百分比。变性凝胶用于分离线性单链核酸(尺寸由碱基表示),而非变性凝胶主要用于双链核酸(bp=碱基对)。

聚丙烯酰胺凝胶(bis,19:1)

 

 

有效分离的范围

 

 

变性凝胶

 

 

4.0

 

 

100-500 bp

 

 

5.0

 

 

70-400 bp

 

 

6.0

 

 

40-300 bp

 

 

8.0

 

 

30-200 bp

 

 

10.0

 

 

20-100 bp

 

 

15.0

 

 

10-50 bp

 

 

20.0

 

 

5-30 bp

 

 

30.0

 

 

1-10 bp

 

 

非变性凝胶

 

 

3.5

 

 

100-1,000 bp

 

 

5.0

 

 

80-500 bp

 

 

8.0

 

 

60-400 bp

 

 

12.0

 

 

50-200 bp

 

 

15.0

 

 

25-150 bp

 

 

20.0

 

 

5-100 bp

 

 

核酸分离,通常采用3–30%(%T)的聚丙烯酰胺凝胶。除%T之外,双丙烯酰胺(交联剂)与总丙烯酰胺(%C)的重量百分比是聚丙烯酰胺凝胶孔隙大小和样品分离的的关键(表4)。

 

%T和%C可以表示为:

%T(w/v)=[(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g/缓冲液ml]x 100%

%C(w/w)=[双丙烯酰胺g/(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g]x 100%

 

表4.聚丙烯酰胺凝胶的常见组分[5]

丙烯酰胺:bis

 

 

%C

 

 

相对孔隙大小

 

 

研究应用

 

 

19:1

 

 

5%

 

 

 

 

DNA和变性凝胶

 

 

29:1

 

 

3.3%

 

 

 

 

非变性凝胶中ssDNA和RNA

 

 

37.5:1

 

 

2.7%

 

 

大型

 

 

蛋白凝胶

 

 

 

聚丙烯酰胺的基本原理

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体聚合而成的聚合物,通常与双丙烯酰胺或N,N'-亚甲基双丙烯酰胺结合使用。交联剂双丙烯酰胺含有两个单位通过亚甲基桥连的丙烯酰胺。聚合是被TEMED 催化(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺)的自由基反应-通常由过硫酸铵(APS)引发(图 5)。因此,在既定温度下,APS和/或TEMED的浓度决定了聚合速率。

图5.丙烯酰胺形成聚丙烯酰胺,双丙烯酰胺结构展示。双丙烯酰胺含有两个单位通过亚甲基桥连的丙烯酰胺(红色)。

 

c.凝胶制备中的缓冲液选择

使用具有导电性的离子溶液制备琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶,确保核酸在电泳过程中具有迁移性。电泳过程中,凝胶和电泳缓冲液通常使用相同类型的缓冲液,以保持相同的pH值和离子强度。核酸电泳常用的两种缓冲液为Tris-醋酸盐EDTA (TAE)和Tris-硼酸盐EDTA (TBE),两者都有接近中性的pH值,有利于带负电荷的核酸。

 

为分析单链DNA或RNA,琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶通常在变性条件下制备和运行。变性条件会破坏核酸之间形成的氢键,从而减少像发夹环这样二级结构的形成。因此对RNA分离和分析而言,变性电泳更常用。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳中常用的变性缓冲液包括:

  1. 琼脂糖:磷酸钠缓冲液中的乙二醛和DMSO、NaOH-EDTA缓冲液、MOPS缓冲液中的甲醛或甲酰胺等

  2. 聚丙烯酰胺: TBE缓冲液中的尿素

2.准备标准品和样品

a.核酸标准品选择

当运行凝胶时,含有已知大小的核酸参照样品通常被称为标准品、标记或 分子量标准,用于目的样品大小的估计。 在为给定样品选择合适的分子量标准时,需考虑如下因素:

  1. Ladde类型(例如DNA或RNA),片段结构(例如单链或双链),构象(例如超螺旋、开环或线性)以确保对迁移进行适当比较

  2. 片段的数量和适当的分离形式,用于大小的估计

  3. 预期用途,如分子量标准是设计用于定性分析还是精确的定量测定

  4. 不同类型凝胶适用的分子量标准(例如,部分预制凝胶推荐设计 特定分子量标准以获得最佳运行结果)

  5. 上样染料的性质,避免目的条带模糊(图6)

  6. 上样缓冲液与使用凝胶的兼容性(例如,缓冲液的盐浓度会影响样品的迁移)

早期,DNA的大小标准主要来源于病毒基因组片段((例如,λφX174)和细菌质粒(如pUC19)的限制内切。该标准物在内切、样品纯度和电泳中带型的重现性方面存在问题。而后,从连接反应和/或PCR中获取的含有片段的分子量标准,因具有再现性且可产生预期大小的片段,而备受青睐。如今,因为色谱纯化片段实现了质量、带型、强度和数量等方面的更高控制,被视为分子量标准黄金标准(图6)。

 

图6.DNA 分子量标准差异。 分子量标准 #2由色谱纯化的DNA片段组成,存在于上佳的上样缓冲液中,可产生相等或预期强度的条带,并且不含有条带污点,无染色阴影。 与此相反,分子量标准 #1采用较老技术制造,并存在于次优组分的缓冲液中。

 

此外,还设计出室温下稳定、适合运输和储存,以及方便和少环境影响的分子量标准。而预混合,即用型分子量标准也可供选择—添加了最佳浓度、可直接上样到凝胶的上样染料的分子量标准。

 

注意,由不同制造商生产、描述相同(例如,1kb或100bp)的分子量标准,包含DNA片段的数量、大小和密度可能会有所不同(图7)。使用前,请参考制造商提供的指南和协议,获取分子量标准组成及其使用用途准确而详细的说明。

 

与DNA分子量标准不同,RNA分子量标准通常与含有变性剂的上样缓冲液一同提供。变性剂可维持RNA的单链形式,确保样品可预测的迁移和分离结果。当运行RNA凝胶电泳时,应避免使用DNA分子量标准,因为双链分离,在变性条件下使用会导致非规则方式分离。

图7.两个不同供应商A和B,提供具有相同描述的DNA分子量标准片段组成差异。

 

b.样品和标准品准备

须计算上样到凝胶中的DNA量,以确保目的条带良好分离,并用于可视化和检测。虽然用荧光染料足以检测1-100ng/条带的DNA,但最小可检测量取决于所用染料[6]。注意,样品或标准品的超载会造成条带污点并遮盖附近条带,从而导致条带分辨不清,特别是片段大小相似时(图8A)。

图8.次优样品分离。 (A) 负载影响条带分辨率。 (B) 上样量过低会导致条带扭曲。

 

在上样缓冲液中准备好样品和分子量标准,其最终的体积通常占胶孔体积的30%。 由于孔底分布不均匀(图8B),使用较少的上样体积会导致条带扭曲。对于含有DNA结合蛋白或粘性末端的样品,凝胶上样之前,混合物需加入至含有SDS的上样染料中一同加热,因为蛋白质结合以及DNA片段之间的相互作用会导致分离效果不佳(图10B)。

 

c .上样染料和缓冲液选择

 

 

制备凝胶电泳时,样品中添加了凝胶上样缓冲液 (通常是6X或10X的原液)。 上样缓冲液包括如下组分:
 

 

 

  1. 密度成分,如甘油或蔗糖,增加样品粘度,确保样品沉入孔中。

  2. ,如Tris-HCl,为样品创造良好的离子强度和pH值环境。 高盐浓度的上样缓冲液会产生更大片或扭曲的条带以及污点。

  3. 金属螯合剂,如EDTA,可阻止样品中的核酸酶降解核酸。

  4. 染料 为监测样品的上样、电泳进展和pH值变化提供了颜色指示。 部分上样缓冲液可能包含多个染料,以便有效跟踪样品中不同大小分子的迁移。

 

 

 

通常,上样染料都是带负电荷的小分子,因此迁移方向与核酸相同。 其中有的显示pH值颜色,上样和运行时可作为样品的pH指示剂(图9A)。 常用染料包括溴酚蓝、二甲苯青,苯酚红,和橙色G。选择上样缓冲液时,需注意染料的表面迁移(s)(图9B, 表5和6)以避免遮盖目的核酸条带,特别是分子大小接近时(图9C)。 染料遮盖会影响目的条带的分析和量化,导致结果不可靠。

图9.(A)中性pH中染料颜色。(B)在TAE和TBE缓冲液中不同百分比琼脂糖里的染料迁移。(C)在可视化过程中染料阴影遮盖条带。

 

有时,上样缓冲液包含清洗剂或还原剂,如SDS, 尿素和甲酰胺,以用于变性。此类添加剂可破坏核酸分子内部和分子间的相互作用,促成线性或单链的分子构象。为获得最佳分离结果,应将样品和变性剂加入至上样染料中一同加热(图 10A)。对来源于酶反应的双链DNA电泳,可将SDS添加到上样缓冲液,以破坏蛋白质和核酸之间的相互作用,防止样品迁移性改变(图10B)。

图10,热量、SDS对样品电泳的影响。(A) 在不加热处理的情况下,将含有RNA分子量标准的变性缓冲液加入凝胶中。 (B) 在有或无SDS的上样缓冲液中准备来源于限制性内切和连接反应的DNA样品。 在凝胶上样前,加热SDS中的样品。

 

表5.琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中,溴酚蓝和二甲苯青FF的表观分子大小[2]

(A)TBE和TAE缓冲液中的琼脂糖凝胶

 

 

 

溴酚蓝

 

 

二甲苯青FF

 

 

凝胶%

 

 

TBE

 

 

TAE

 

 

TBE

 

 

TAE

 

 

0.5

 

 

750 bp

 

 

1,150 bp

 

 

13,000 bp

 

 

16,700 bp

 

 

0.6

 

 

540 bp

 

 

850 bp

 

 

8,820 bp

 

 

11,600 bp

 

 

0.7

 

 

410 bp

 

 

660 bp

 

 

6,400 bp

 

 

8,500 bp

 

 

0.8

 

 

320 bp

 

 

530 bp

 

 

4,830 bp

 

 

6,500 bp

 

 

0.9

 

 

260 bp

 

 

440 bp

 

 

3,770 bp

 

 

5,140 bp

 

 

1.0

 

 

220 bp

 

 

370 bp

 

 

3,030 bp

 

 

4,160 bp

 

 

1.2

 

 

160 bp

 

 

275 bp

 

 

2,070 bp

 

 

2,890 bp

 

 

1.5

 

 

110 bp

 

 

190 bp

 

 

1,300 bp

 

 

1,840 bp

 

 

2.0

 

 

65 bp

 

 

120 bp

 

 

710 bp

 

 

1,040 bp

 

 

3.0

 

 

30 bp

 

 

60 bp

 

 

300 bp

 

 

460 bp

 

 

4.0

 

 

18 bp

 

 

40 bp

 

 

170 bp

 

 

260 bp

 

 

5.0

 

 

12 bp

 

 

27 bp

 

 

105 bp

 

 

165 bp

 

 

(B)变性和非变性缓冲液中的聚丙烯酰胺凝胶

酰胺: bis (19:1), 胶凝%

 

 

溴酚蓝

 

 

二甲苯青FF

 

 

变性凝胶

 

 

4.0

 

 

50碱基

 

 

230碱基

 

 

5.0

 

 

35碱基

 

 

130碱基

 

 

6.0

 

 

26碱基

 

 

105碱基

 

 

8.0

 

 

19碱基

 

 

75碱基

 

 

10.0

 

 

12碱基

 

 

55碱基

 

 

15.0

 

 

10碱基

 

 

40碱基

 

 

20.0

 

 

8碱基

 

 

28碱基

 

 

30.0

 

 

6碱基

 

 

20碱基

 

 

非变性凝胶

 

 

3.5

 

 

100 bp

 

 

460 bp

 

 

5.0

 

 

65 bp

 

 

260 bp

 

 

8.0

 

 

45 bp

 

 

160 bp

 

 

12.0

 

 

20 bp

 

 

70 bp

 

 

15.0

 

 

15 bp

 

 

60 bp

 

 

20.0

 

 

12 bp

 

 

45 bp

 

 

3.运行电泳

在凝胶、标准品和样品制备后,进行电泳。拆卸梳子和添加电泳缓冲液前,凝胶须完全凝固。凝胶梳应平稳地向上提起,以免撕裂凝胶、扭曲胶孔。移除梳子和添加缓冲液后,注意清除孔里的气泡。对于聚丙烯酰胺凝胶,应用缓冲液彻底冲洗胶孔,以清除残留未聚合的丙烯酰胺。

 

水平凝胶应朝向凝胶盒,样品孔位于负极一侧,以便在电泳启动后,将样品移动至正电极侧(图11A)。该方向可记为“跑向红色”,因为正电极通常为红色。 垂直凝胶盒中,胶孔设计在顶部(图11B)。

图11.水平和垂直电泳系统的凝胶装置。 箭头表示电泳中核酸迁移的方向。

 

a.电泳缓冲液选择

电泳缓冲液为具有缓冲能力的离子溶液,通常在凝胶中使用,以保证电流流动同时防止pH值变化。电泳过程中,由于电子流动,负极逐渐偏向碱性,正极逐渐偏向酸性,从而导致水电解和pH值改变(表6)。氢气和氧气的释放会引起电极起泡,这是凝胶运行的迹象。理想情况下,电泳缓冲液和凝胶制备缓冲液应相同,以确保有效的导电性。

 

表6.两个电极的化学反应和pH值变化。

电极

 

 

负极(-)

 

 

正极(+)

 

 

电子流

 

 

In

 

 

 

 

化学反应

 

 

4 H2O + 4 e– → 2 H2 (gas) + 4 OH–

 

 

2 H2O → O2 (gas) + 4 H+ + 4 e–

 

 

pH变化

 

 

基本

 

 

酸性

 

 

 

电泳缓冲液的选择取决于样品大小、运行时间和后电泳过程,其中Tris-醋酸盐EDTA(TAE)和Tris-硼酸 EDTA(TBE)是最常用的两种缓冲液(表 7)[2,7]

  1. 因为不容易形成污点,TAE适用于>1500bp的片段。由于缓冲能力较低,TAE更适合短时间的电泳运行(例如<2小时)。TAE缓冲能力较低,长时间运行凝胶会导致过热,样品变性和/或扩散以及凝胶融化(可能)。

  2. TBE缓冲能力较高,不易导致过热,因此更适合长时间运行。对于较短片段的分离,TBE效果更佳,而在TBE中,dsDNA迁移得更慢。TBE可抑制酶,因此不适合涉及酶学步骤的下游应用,如限制内切、克隆和PCR。

使用离子强度高于1X TAE或0.5-1X TBE缓冲液,可更快地移动样品,但由于高导电性会产生大量的热量,容易导致样品变性和凝胶损伤。

 

表7.缓冲液选择指南。

缓冲液

 

 

产品优势

 

 

缺点

 

 

核酸分辨率

 

 

DNA

 

 

RNA

 

 

TAE

 

 

  1. 可更好地分离大片段

  2. 缓冲能力低;更适用于短时间运行

  3. 适合下游的酶学应用

 

 

 

 

 

 

更容易导致过热

 

 

 

 

 

>1,000 bp

 

 

>1,500 bp

 

 

TBE

 

 

  1. 适用于短片段(线性dsDNA在TBE中迁移慢10%)

  2. 离子强度高、缓冲能力强;适用于长时间运行

  3. 不易导致过热

 

 

 

 

 

 

抑制酶,不适合下游酶学步骤(如克隆)

 

 

<5,000 bp

 

 

<1,500 bp

 

 

凝胶应完全浸在缓冲液中,以确保离子流动,防止凝胶干(图12A)。然而,当使用水平凝胶时(例如,琼脂糖),凝胶上的缓冲液深度应低于3–5mm。缓冲液过高(>5 mm)会导致核酸迁移性降低,加大条带扭曲和过热。

图12.电泳缓冲液对电泳的影响。(A) 在电泳过程中,凝胶的顶部部分未被浸没。(B) 在低于推荐浓度的盐浓度缓冲液中运行凝胶(与凝胶制备中使用的缓冲液不同)。

 

注意,变性琼脂糖的电泳缓冲液可能既不是TAE,也不是TBE,因为这些凝胶可能在不同的缓冲液中制备,如磷酸钠和MOPS。选择与所用凝胶兼容的电泳缓冲液非常重要(图12B)。

 

b.电压

采用恒定电压、电流或功率通过凝胶,施加电势,开始运行凝胶。核酸电泳中常用恒压,一般为5–10 V/cm。

 

施加的电压(V)=电极间的距离(cm)x建议V/cm

 

可根据需要分离的DNA片段的大小调整电压,也可以根据所使用的电泳缓冲液的类型进行调整(表 8)。市售核酸分子量标准通常提供建议电压,以便每个产品片段实现最佳分离。注意,电压极低会减缓核酸的迁移,从而导致小分子的扩散和分辨率过低(图13A)。另一方面,电压过高,会导致较差的分离效果和样品污点;有时,还会造成缓冲液过热,“微笑型条带”,甚至是样品变性(图13B)。

图13. 电压对DNA电泳的影响。 (A)低电压导致条带分辨率差和扩散。 (B)高电压导致“微笑型条带”。

 

表8. 基于片段大小的运行条件[2]

DNA大小

 

 

电压

 

 

最佳电泳缓冲液

 

 

<1 kb

 

 

5-10 V/cm

 

 

TBE

 

 

1-5 kb

 

 

4-10 V/cm

 

 

TAE 或 TBE

 

 

>5kb

 

 

1-3 V/cm

 

 

TAE

 

 

最长 10 kb

 

 

最高 23 V/cm

 

 

TAE

 

 

某些情况下,可将温度探头连接至凝胶装置,以帮助控制缓冲液的冷却和加热。 电泳运行>2小时,缓冲液的冷却和再循环可改善样品分离。变性凝胶允许缓冲液加热至55°C,从而改善核酸单链形式,提升实验结果。

 

c.运行时间

凝胶长度、所用电压和样品中的分子大小决定电泳所需的时间。通常,电泳会持续到目的条带迁移至凝胶长度的40-60%。凝胶运行的特定时间,可观察到上样染料的相对位置,直至溴酚蓝染料已迁移约60%的凝胶长度和/或橙G染料已迁移80%的凝胶长度。此外,应监测运行时间,以确保样品或标准品中最小的分子不移出凝胶。注意,运行时间过短则不能完全分辨条带(图14)。含有示踪染料的DNA分子量标准可协助监测凝胶的运行,同时也可确保条带不被染料所遮盖。

图14.运行时间对样品分离的影响。

 

4.在凝胶中可视化样品

凝胶运行完成后,需对样品进行可视化分析。由于普通照明环境下,核酸不可见,因此需要一种可视化的检测方法。如表9所述,可用方法在样品检测中,提供了不同的灵敏度和增益范围[6]

 

表9.常见的核酸凝胶染色和检测方法。

染料

 

 

优点和注意事项

 

 

检测灵敏度(近似dsDNA数量)

 

 

比色法

 

 

亚甲基蓝

 

 

结晶紫

 

 

  1. 无需特殊设备

  2. 需脱色

  3. 低灵敏度

 

 

 

 

 

 

0.5 -1 μg

 

 

荧光

 

 

EB(溴化乙锭)

 

 

Invitrogen SYBR安全染料

 

 

Invitrogen SYBR绿色染料

 

 

Invitrogen SYBR金色染料

 

 

  1. 需用紫外和/或蓝光激发

  2. 经常导致突变

  3. 需进行特别废物处置

  4.  提供较短的工作流程,灵敏度高

  5. 可用于电泳中或后样品染色

 

 

 

 

 

25pg - 1 ng

 

 

放射性

 

 

32P

 

 

33P

 

 

3H

 

 

  1. 需对放射性安全进行培训和预防

  2. 通过放射性探针或核苷酸检测或标记样品

  3. 常见寡核苷酸检测

  4. 最灵敏

 

 

 

 

 

10 fg-1 ng

 

 

a.荧光染色

现有的染色剂中,因荧光染料易于使用,灵敏度高,所以在样品检测中应用最为广泛(图15)。 当用适当波长激发时,染料发出可见光(即,荧光)。荧光强度与其和核酸结合的数量有关—这是检测和定量测定电泳中核酸的基础。

图15.不同类型的核酸结合染料。

 

溴化乙锭(EtBr) 染色时间短(约30分钟),灵敏度高(可检测到1 ng双链DNA/条带),为核酸电泳中的常用荧光染料。还可考虑另一种染料,原因如下:

  1. 诱变和处置: 溴化乙锭是高度诱变剂,所以荧光染料的 危险性较小,无需特殊处理,在核酸电泳中可提供安全工作流程(图16)。

  2. 灵敏度:灵敏度高于EtBr的荧光染料,适合检测少量样品(图16)。 因为有较少的碱基堆积,单链核酸的可视化通常需要更多样品和/或嵌入染料。 因此, 优先结合单链核酸的染料是RNA电泳样品检测的最佳选择。

  3. 紫外线损害:可用低能量蓝光(而非紫外光)来激发的荧光染料对核酸结构损伤较小,其灵敏度(图17A)不仅相同,甚至更高。 因此,电泳中使用蓝光激发可提高下游的成功应用,如克隆和测序(图17B)。

图16.特性增强的溴化乙锭替代品

图17.(A)常见核酸染色的激发和发射光谱。最有效的波长被称为激发极大值。SYBR安全与SYBR金染料通过蓝光和较低的紫外光可最大程度激发。(B)用蓝光(针对SYBR安全染料)或紫外光(溴化乙锭)后的克隆效率,用于在电泳过程中显示克隆插入。用x-Gal培养皿上形成的蓝色菌落数量来衡量胶-纯化lacZ片段的克隆效率,其表明已将功能(未突变的)基因插入到载体中。

 

b.紫外阴影

在染料染色处,可通过称作紫外阴影的方法间接观察核酸,利用核酸[8]来吸收紫外线。该方法通常用于通过电泳分离和纯化寡核苷酸和RNA,这种情况下,简单检测已足够,和/或使用嵌入染料会影响下游的应用。为通过紫外阴影进行检测,需要纳克到微克的样品,并使用薄而透明的凝胶(如聚丙烯酰胺)以确保紫外线的吸收和透射。紫外阴影方法中,电泳后将凝胶从盒中取出(以便最大程度检测),用透明的塑料薄膜包裹后放置在UV-荧光薄层色谱板上。当凝胶至于紫外线辐射下时,核酸条带的吸收会在TLC板上投射阴影(图18)。将所需大小凝胶的阴影部分剪去,以作进一步处理。

图18.紫外阴影使分离的片段显象。

 

5.记录凝胶

a.荧光成像技术

可视化后,核酸凝胶通常被存档记录下来,用于记录和分析电泳结果。如果样品被荧光染料染色,需特殊设备以适当的光源激发染料,使其显象并捕捉凝胶图像。激发光源在凝胶上,称为反射照明器(类似于手持式紫外线灯),或在凝胶下,称为透照器 (图19)。由于反射照明器上的光源位置较远,所以样品收到的能量较少。这样可以减少紫外线对核酸的损害,但也会降低凝胶条带的信号。另一方面,透照器可为条带提供更高的信号,但由于辐射接近凝胶,会增加紫外线造成的伤害。

图19.反射照明器和透照器。

 

b.放射自显影法

在放射性核酸的电泳过程中,凝胶电泳后会暴露在x射线胶片上,这一过程即称为 放射自显影法。条带辐射的强度可用光密度测定来定量。

 

综上所述,核酸电泳工作流程采用多种步骤和试剂来分离和分析样品。为您的样品选择合适工具,并识别工作流程的优缺点,可显著提高分子生物学应用的电泳结果。

 

 

参考文献
1.Stellwagen NC (1998) DNA Gel Electrophoresis. In: Tietz D (editor), Nucleic Acid Electrophoresis (Springer Lab Manual). Heidelberg: Springer. pp 1–53.
2.Green MR, Sambrook J (2012) Analysis of DNA. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp 81–156.

3.Yilmaz M, Ozic C, Gok I (2012) Principles of Nucleic Acid Separation by Agarose Gel Electrophoresis. In: Magdeldin S (editor), Gel Electrophoresis: Principles and Basics. Rijeka: InTech. pp 33–40.

4.Lee SV, Bahaman AR (2012) Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. In: Magdeldin S (editor), Gel Electrophoresis: Principles and Basics. Rijeka: InTech. pp 41–56.

5.Barril P, Nates Silivia (2012) Introduction to Agarose and Polyacrylamide Gel Electrophoresis Matrices with Respect to their Detection Sensitivities. In: Magdeldin S (editor), Gel Electrophoresis: Principles and Basics. Rijeka: InTech. pp 3–14.

6.Thermo Fisher Scientific Inc (2010) Nucleic Acid Detection and Analysis. In: Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. pp 349–360.

7.Brody JR, Kern SE (2004) History and principles of conductive media for standard DNA electrophoresis. Anal Biochem 333(1):1–13.

8.Hassur SM, Whitlock HW Jr (1974) UV shadowing--a new and convenient method for the location of ultraviolet-absorbing species in polyacrylamide gels. Anal Biochem 59(1):162–164.

 

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